2 Material

 > 2.1  Bakterienstämme
 > 2.2  Plasmide
 > 2.3  Nährmedien
 > 2.4  Antibiotika
 > 2.5  Puffer und Lösungen
 > 2.6  Bezugsquellen für Chemikalien


  2.1  Bakterienstämme

Die in dieser Arbeit verwendeten Bakterienstämme sind in folgender Liste (Tab.1) aufgeführt:

Tabelle 1: Verwendete Bakterienstämme

 

Bakterienstämme

Geno- bzw. Phänotyp

Referenz / Herkunft

Escherichia coli HB101

supE44, recA, lacY1, proA2, leuB6, ara-14, hsdS20(rB-mB-), galK2

Boyer & Roulland-Dussoix, 1969

Enterobacter agglomerans 243

prototroph, Nif + , OrnDC+ , GelH-

Kleeberger et al., 1983

Enterobacter agglomerans 333

prototroph, Nif + , OrnDC+ , GelH-

Kleeberger et al., 1983

Enterobacter agglomerans 334

prototroph, Nif + , OrnDC- , GelH-

Kleeberger et al., 1983

Enterobacter agglomerans 335

prototroph, Nif + , OrnDC- , GelH+

Kleeberger et al., 1983

Enterobacter agglomerans 339

prototroph, Nif + , OrnDC- , GelH-

Kleeberger et al., 1983

Enterobacter agglomerans 335/18-1

prototroph, Nif -

Singh et al., 1983

Enterobacter agglomerans 339/22-1

prototroph, Nif -

Singh et al., 1983

Enterobacter agglomerans 339- a

prototroph, Nif -, Rif r,

C. Fentner

Enterobacter agglomerans 339- b

prototroph, Nif -, Rif r, Nalr

C. Fentner

Enterobacter agglomerans 339- c

prototroph, Nif -, Rif r, Smr

C. Fentner

Enterobacter agglomerans 19-78

prototroph, Nif - , OrnDC-

Berge et al., 1991

Pantoea agglomerans

prototroph, Nif - , OrnDC-

Ruppel., 1987

Rahnella aquatilis 2-87

prototroph, Nif - , OrnDC-

Berge et al., 1991

Rahnella aquatilis 3-88

prototroph, Nif - , OrnDC-

Berge et al., 1991

Rahnella aquatilis ATCC 33989

prototroph, Nif - , OrnDC-

Berge et al., 1991

Rahnella aquatilis ATCC 33071

prototroph, Nif + , OrnDC+

Berge et al., 1991

ATCC - American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA



  2.2 Plasmide

Die in dieser Arbeit verwendeten Plasmide sind in folgender Liste (Tab.2) aufgeführt:

 

Tabelle 2: Verwendete Plasmide

_________________________________________________________________________

Plasmid Geno- bzw. Phänotyp Referenz

_________________________________________________________________________

pUC18

Apr, lacZa+

Yanisch-Perron et al., 1985

pEA9

Nif +

Singh et al., 1983

pHD4

Apr, Cosmidklon von pEA9

Steibl, 1989

pHD10

Apr, Cosmidklon von pEA9

Steibl, 1989

pHD21

Apr, Cosmidklon von pEA9

Steibl, 1989

pHD39

Apr, Cosmidklon von pEA9

Steibl, 1989

pHD41

Apr, Cosmidklon von pEA9

Steibl, 1989

pHD54

Apr, Cosmidklon von pEA9

Steibl, 1989

pHD62

Apr, Cosmidklon von pEA9

Steibl, 1989

pJJ0.8SB

Apr, Subklon von pHD54

Steibl1

pJJ5.4HB

Apr, Subklon von pHD54

Steibl1

pJJ5.4HD 0.2

Apr, Deletionsklon von pJJ5.4HB

diese Arbeit

pJJ5.4HD 0.35

Apr, Deletionsklon von pJJ5.4HB

diese Arbeit

pJJ5.4HD 0.4

Apr, Deletionsklon von pJJ5.4HB

diese Arbeit

pJJ5.4HD 0.7

Apr, Deletionsklon von pJJ5.4HB

diese Arbeit

pJJ5.4HD 1.0

Apr, Deletionsklon von pJJ5.4HB

diese Arbeit

pJJ1.4B

Apr, Subklon von pHD54

diese Arbeit

pJJ3.8SphA

Apr, Subklon von pHD54

diese Arbeit

pJJ3.8SphB

Apr, Subklon von pHD54

diese Arbeit

_________________________________________________________________________

1 - Dissertation (in Vorbereitung)

 

 

  2.3 Nährmedien

 

LB-Medium 10 g Caseinhydrolysat

5 g Hefeextrakt

5 g NaCl

ad 1 l H2 O (demineralisiert)

Zur Herstellung fester Nährmedien wurden vor dem Autoklavieren 15 g Agar / l Medium zugesetzt.

 

Citrat-Medium 1 g NH4 H2 PO4

[Simmons, 1926] 1 g K2 HPO4

5 g NaCl

2 g Natriumcitrat

0.2 g MgSO4 [ 7 H2 O]

0.8 g Bromthymolblau

ad 1 l H2 O (demineralisiert), pH 6.9

Zur Herstellung fester Nährmedien wurde Simmons Citrat Agar der Fa. MERCK/Darmstadt verwendet .

Die jeweiligen Kulturmedien wurden bei 121°C und 1 bar Überdruck für 40 min autoklaviert. Nach Abkühlen der Medien auf ca. 60°C wurden die entsprechenden Antibiotika in Form vorbereiteter Stammlösungen zugegeben.




  2.4 Antibiotika

Die verwendeten Antibiotika und deren Konzentrationen sind in Tabelle 3 aufgeführt.

Tabelle 3: Antibiotika

Antibiotikum

Stammlösung

Endkonzentration

[mg/ml H2 O]

[µg/ml Medium]

     

Ampicillin

100

100

Nalidixinsäure

20

10

Rifampicin

100

100

Streptomycin

100

200

     


Ap und Sm wurden in bidestilliertem Wasser, Nal in 0.2 N NaOH und Rif in 96 % Methanol gelöst. Wäßrige Stammlösungen wurden sterilfiltriert ( SARTORIUS, Zellulose-Acetat-Filter, 0.2 µm) und aliquotiert bei -20°C gelagert. Rif wurde als gebrauchsfertige Stammlösung im Kühlschrank aufbewahrt.



  2.5 Puffer und Lösungen

Lösungen für die:

Isolierung und Aufreinigung von DNA

Chloroform- Isoamylalkohol wurde Chloroform im Verhältnis 1:24 (v/v) zugesetzt.

Isoamylalkohol

CTAB-N 10 % CTAB, 0.7 M NaCl

Nach dem Lösen von 4.1 g NaCl in 80 ml ddH2 O wurden bei 65°C unter ständigem Rühren langsam 10 g CTAB zugegeben und das Volumen anschließend mit ddH2 O auf 100 ml aufgefüllt.

GET-Puffer 50 mM Glucose, 25 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA

Die autoklavierte Lösung wurde bei 4°C im Kühlschrank gelagert.

GETL-Puffer 40 mg Lysozym / 10 ml GET-Puffer

K-Acetatlösung 3 M KAcetat (pH 4.8)

Zur Herstellung der Lösung wurden 60.0 ml 5 M Kaliumacetatlsg., 11.5 ml Eisessig und 28.5 ml ddH2O zusammenpipettiert.

Lysismix 1 % (w/v) SDS in 0.2 N NaOH

Lyse-Puffer 6 % (w/v) SDS in 0.25 N NaOH

Na-Acetatlösung 3 M NaAcetat (pH 4.8)

Zur Herstellung der Lösung wurden 60.0 ml 5 M Natriumacetatlösung, 11.5 ml Eisessig und 28.5 ml ddH2 O zusammenpipettiert

Proteinase K-Lsg. 20 mg Proteinase K in 1 ml ddH2 O

RNase-Lösung 20 mg RNase wurden in 2 ml 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 15 mM NaCl gelöst, 15 min bei 100°C gekocht, nach dem Abkühlen aliquotiert und bei -20°C gelagert.

Saures Phenol Kristallines Phenol wurde bei 60°C im Wasserbad aufgeschmolzen und mit Chloroform-Isoamylalkohol im Verhältnis 1:1 (v/v) gemischt.

TAE-Puffer 75 mM Tris-Acetat (pH 7.3), 1 mM EDTA

TE-Puffer 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA

TELT-Puffer 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)

2.5 M LiCl, 62.5 mM EDTA, 4 % (v/v) Tritonâ X-100

TEN-Puffer 200 mM Tris-HCl (pH 9.0), 0.5 mM EDTA, 10 mM NaCl

TER-Puffer 0.6 mg RNase in 30 ml TE-Puffer




Agarosegelelektrophorese

EtBr-Färbelösung 2 µg/ml Ethidiumbromid in 1 TBE-Puffer

6 Gel-Ladepuffer 40 % (w/v) Sucrose in ddH2 O

0.25 % Xylencyanol FF, 0.25 % Bromphenolblau

Der Puffer wurde bei 4°C im Kühlschrank aufbewahrt.

0.5 TBE-Puffer 45 mM Tris (pH 8.35), 45 mM Borat, 1 mM EDTA

 

 

Southern Transfer

Denaturierungs-Lsg. 1.5 M NaCl, 0.5 N NaOH

Neutralisierungs-Lsg. 1.0 M Tris-HCl (pH 8.0), 1.5 M NaCl

20 SSC 3.0 M NaCl, 0.3 M NaCitrat (pH 7.0)




Hybridisierung

Prähybridisierungs- 5 SSC

lösung 2 % (w/v) Blocking-Reagenz

0.1 % (w/v) N-Lauroylsarcosin

0.02 % (w/v) SDS

Nach Zugabe dieser Substanzen mußte das Gemisch für 1 h bei 60°C inkubiert werden. Der trüben Lösung wurde anschließend das gleiche Volumen Formamid zugesetzt. Die Lösung wurden bis zum Gebrauch bei -20°C gelagert.

Wasch-Lösung I 0.1 % (w/v) SDS in 2 SSC

Wasch-Lösung II 0.1 % (w/v) SDS in 0.1 SSC

Detect-Puffer I 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl

Detect-Puffer II 0.5 % (w/v) Blocking-Reagenz in Detect-Puffer I

Detect-Puffer III 100 mM Tris-HCl (pH 9.5), 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2

Antikörper-Lösung ' Dig-Antibody-Konjugat' 1:5000 mit Detect-Puffer I verdünnt

(150 mUnits/ml)

Färbelösung 35 µl X-Phosphat-Lösung (5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat)

45 µl NBT-Lösung (Nitroblau-tetrazolium-chlorid)

10 ml Detect-Puffer III




DNA-Sequenzierung

Bindesilan-Lösung Zur Herstellung der Lösung wurden 1350 µl ddH2 O, 50 ml 96 % Ethanol, 150 µl Bindesilan und 150 µl Eisessig zusammenpipettiert.

Polyacrylamidlösung Zur Herstellung der gebrauchsfertigen Lösung wurden 24 g Harnstoff in einem Gemisch von 16 ml ddH2 O, 7.5 ml 40 % Acrylamid/Bis-Lösung und 5 ml zehnfach konzentriertem TBE-Puffer vollständig gelöst, durch einen Papier-Faltenfilter filtriert und 10 min entgast.



a-Komplementation

IPTG-Lösung 2 g IPTG in 10 ml ddH2 O, sterilfiltriert bei -20°C gelagert

X-Gal-Lösung 40 mg X-Gal in 2 ml Dimethylformamid, Lagerung bei -20°C




  2.6. Bezugsquellen für Chemikalien

Sofern nicht in Tabelle 4 aufgeführt, wurden die verwendeten Chemikalien von MERCK/Darmstadt bezogen oder sind im jeweiligen Methodenteil separat aufgeführt. Die Restriktionsenzyme SalI und BamHI stammten von der Fa. USB, HindIII von LKB/Pharmacia und PstI von EUROGEN. Alle anderen verwendeten Restriktionsenzyme wurden von Gibco BRL bezogen. Die jeweiligen Restriktionspuffer stammten vom Hersteller des entsprechenden Restriktionsenzyms.




Tabelle 4: Bezugsquellenverzeichnis

Chemikalie / Produkt

Bezugsquelle / Hersteller

Acrylamid 40%

Carl-Roth-GmbH & Co., Karlruhe

Agar

GIBCO BRL, Paisley, GB

Agarose

GIBCO BRL, Paisley, GB

Alkalische Shrimp Phosphatase

USB, Cleveland, USA

Ammoniumpersulfat

BIO-RAD Laboratories, Richmond, USA

Ampicillin (Natriumsalz)

SIGMA, St. Louis, USA

Bindesilan

LKB/Pharmacia, Bromma, Schweden

Bromthymolblau

Serva, Heidelberg

Casein-Hydrolysat

GIBCO BRL, Paisley, GB

Chloramphenicol

Serva, Heidelberg

Cäsiumchlorid

GIBCO BRL, Paisley, GB

CTAB

Serva, Heidelberg

DNA Labeling and Detection Kit non radioactive

Boehringer, Mannheim

Double-stranded Nested Deletion Kit

LKB/Pharmacia, Bromma, Schweden

EDTA

Serva, Heidelberg

Formamid

LKB/Pharmacia, Bromma, Schweden

Hefe-Extrakt

GIBCO BRL, Paisley, GB

Kilobasenleiter

GIBCO BRL, Paisley, GB

Klenow-Fragment

LKB/Pharmacia, Bromma, Schweden

M13 Reverse Sequence Primer

LKB/Pharmacia, Bromma, Schweden

l-DNA

GIBCO BRL, Paisley, GB

Ligasepuffer 5

GIBCO BRL, Paisley, GB

Lysozym

FLUKA Chemie AG, Buchs, Schweiz

Nalidixinsäure

Serva, Heidelberg

N-Lauroylsarcosin

SIGMA, St. Louis, USA

Phenol-Chloroform

Carl-Roth-GmbH & Co., Karlruhe

Phenol-Tris

Carl-Roth-GmbH & Co., Karlruhe

Phosphatasepuffer 10

USB, Cleveland, USA

Proteinase K

SIGMA, St. Louis, USA

Repel-Silan

LKB/Pharmacia, Bromma, Schweden

Rifampicin

FLUKA Chemie AG, Buchs, Schweiz

RNase H

SIGMA, St. Louis, USA

[a 35S]-dATP

Amersham Buchler, Braunschweig

SDS

Serva, Heidelberg

Streptomycin

Serva. Heidelberg

TEMED

LKB/Pharmacia, Bromma, Schweden

Tris

Serva, Heidelberg

TritonÒ X-100

W. Zinsser Scintillators, Frankfurt

T7-Sequencing-Kit

LKB/Pharmacia, Bromma, Schweden

T4 DNA-Ligase

GIBCO BRL, Paisley, GB

Xylencyanol FF

Serva, Heidelberg





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