2 Material > 2.1 Bakterienstämme > 2.2 Plasmide > 2.3 Nährmedien > 2.4 Antibiotika > 2.5 Puffer und Lösungen > 2.6 Bezugsquellen für Chemikalien 2.1 Bakterienstämme Die in dieser Arbeit verwendeten Bakterienstämme sind in folgender Liste (Tab.1) aufgeführt: Tabelle 1: Verwendete Bakterienstämme
ATCC - American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA 2.2 Plasmide Die in dieser Arbeit verwendeten Plasmide sind in folgender Liste (Tab.2) aufgeführt:
Tabelle 2: Verwendete Plasmide _________________________________________________________________________ Plasmid Geno- bzw. Phänotyp Referenz _________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________ 1 - Dissertation (in Vorbereitung)
2.3 Nährmedien
LB-Medium 10 g Caseinhydrolysat 5 g Hefeextrakt 5 g NaCl ad 1 l H2 O (demineralisiert) Zur Herstellung fester Nährmedien wurden vor dem Autoklavieren 15 g Agar / l Medium zugesetzt.
Citrat-Medium 1 g NH4 H2 PO4 [Simmons, 1926] 1 g K2 HPO4 5 g NaCl 2 g Natriumcitrat 0.2 g MgSO4 [“ 7 H2 O] 0.8 g Bromthymolblau ad 1 l H2 O (demineralisiert), pH 6.9 Zur Herstellung fester Nährmedien wurde Simmons Citrat Agar der Fa. MERCK/Darmstadt verwendet . Die jeweiligen Kulturmedien wurden bei 121°C und 1 bar Überdruck für 40 min autoklaviert. Nach Abkühlen der Medien auf ca. 60°C wurden die entsprechenden Antibiotika in Form vorbereiteter Stammlösungen zugegeben. Die verwendeten Antibiotika und deren Konzentrationen sind in Tabelle 3 aufgeführt. Tabelle 3: Antibiotika
Ap und Sm wurden in bidestilliertem Wasser, Nal in 0.2 N NaOH und Rif in 96 % Methanol gelöst. Wäßrige Stammlösungen wurden sterilfiltriert ( SARTORIUS, Zellulose-Acetat-Filter, 0.2 µm) und aliquotiert bei -20°C gelagert. Rif wurde als gebrauchsfertige Stammlösung im Kühlschrank aufbewahrt. 2.5 Puffer und Lösungen Lösungen für die: Isolierung und Aufreinigung von DNA Chloroform- Isoamylalkohol wurde Chloroform im Verhältnis 1:24 (v/v) zugesetzt. Isoamylalkohol CTAB-N 10 % CTAB, 0.7 M NaCl Nach dem Lösen von 4.1 g NaCl in 80 ml ddH2 O wurden bei 65°C unter ständigem Rühren langsam 10 g CTAB zugegeben und das Volumen anschließend mit ddH2 O auf 100 ml aufgefüllt. GET-Puffer 50 mM Glucose, 25 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA Die autoklavierte Lösung wurde bei 4°C im Kühlschrank gelagert. GETL-Puffer 40 mg Lysozym / 10 ml GET-Puffer K-Acetatlösung 3 M KAcetat (pH 4.8) Zur Herstellung der Lösung wurden 60.0 ml 5 M Kaliumacetatlsg., 11.5 ml Eisessig und 28.5 ml ddH2O zusammenpipettiert. Lysismix 1 % (w/v) SDS in 0.2 N NaOH Lyse-Puffer 6 % (w/v) SDS in 0.25 N NaOH Na-Acetatlösung 3 M NaAcetat (pH 4.8) Zur Herstellung der Lösung wurden 60.0 ml 5 M Natriumacetatlösung, 11.5 ml Eisessig und 28.5 ml ddH2 O zusammenpipettiert Proteinase K-Lsg. 20 mg Proteinase K in 1 ml ddH2 O RNase-Lösung 20 mg RNase wurden in 2 ml 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 15 mM NaCl gelöst, 15 min bei 100°C gekocht, nach dem Abkühlen aliquotiert und bei -20°C gelagert. Saures Phenol Kristallines Phenol wurde bei 60°C im Wasserbad aufgeschmolzen und mit Chloroform-Isoamylalkohol im Verhältnis 1:1 (v/v) gemischt. TAE-Puffer 75 mM Tris-Acetat (pH 7.3), 1 mM EDTA TE-Puffer 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA TELT-Puffer 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) 2.5 M LiCl, 62.5 mM EDTA, 4 % (v/v) Tritonâ X-100 TEN-Puffer 200 mM Tris-HCl (pH 9.0), 0.5 mM EDTA, 10 mM NaCl TER-Puffer 0.6 mg RNase in 30 ml TE-Puffer Agarosegelelektrophorese EtBr-Färbelösung 2 µg/ml Ethidiumbromid in 1“ TBE-Puffer 6“ Gel-Ladepuffer 40 % (w/v) Sucrose in ddH2 O 0.25 % Xylencyanol FF, 0.25 % Bromphenolblau Der Puffer wurde bei 4°C im Kühlschrank aufbewahrt. 0.5“ TBE-Puffer 45 mM Tris (pH 8.35), 45 mM Borat, 1 mM EDTA
Southern Transfer Denaturierungs-Lsg. 1.5 M NaCl, 0.5 N NaOH Neutralisierungs-Lsg. 1.0 M Tris-HCl (pH 8.0), 1.5 M NaCl 20“ SSC 3.0 M NaCl, 0.3 M NaCitrat (pH 7.0) Hybridisierung Prähybridisierungs- 5“ SSC lösung 2 % (w/v) Blocking-Reagenz 0.1 % (w/v) N-Lauroylsarcosin 0.02 % (w/v) SDS Nach Zugabe dieser Substanzen mußte das Gemisch für 1 h bei 60°C inkubiert werden. Der trüben Lösung wurde anschließend das gleiche Volumen Formamid zugesetzt. Die Lösung wurden bis zum Gebrauch bei -20°C gelagert. Wasch-Lösung I 0.1 % (w/v) SDS in 2“ SSC Wasch-Lösung II 0.1 % (w/v) SDS in 0.1“ SSC Detect-Puffer I 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl Detect-Puffer II 0.5 % (w/v) Blocking-Reagenz in Detect-Puffer I Detect-Puffer III 100 mM Tris-HCl (pH 9.5), 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2 Antikörper-Lösung ' Dig-Antibody-Konjugat' 1:5000 mit Detect-Puffer I verdünnt (150 mUnits/ml) Färbelösung 35 µl X-Phosphat-Lösung (5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat) 45 µl NBT-Lösung (Nitroblau-tetrazolium-chlorid) 10 ml Detect-Puffer III DNA-Sequenzierung Bindesilan-Lösung Zur Herstellung der Lösung wurden 1350 µl ddH2 O, 50 ml 96 % Ethanol, 150 µl Bindesilan und 150 µl Eisessig zusammenpipettiert. Polyacrylamidlösung Zur Herstellung der gebrauchsfertigen Lösung wurden 24 g Harnstoff in einem Gemisch von 16 ml ddH2 O, 7.5 ml 40 % Acrylamid/Bis-Lösung und 5 ml zehnfach konzentriertem TBE-Puffer vollständig gelöst, durch einen Papier-Faltenfilter filtriert und 10 min entgast. a -KomplementationIPTG-Lösung 2 g IPTG in 10 ml ddH2 O, sterilfiltriert bei -20°C gelagert X-Gal-Lösung 40 mg X-Gal in 2 ml Dimethylformamid, Lagerung bei -20°C 2.6. Bezugsquellen für Chemikalien Sofern nicht in Tabelle 4 aufgeführt, wurden die verwendeten Chemikalien von MERCK/Darmstadt bezogen oder sind im jeweiligen Methodenteil separat aufgeführt. Die Restriktionsenzyme SalI und BamHI stammten von der Fa. USB, HindIII von LKB/Pharmacia und PstI von EUROGEN. Alle anderen verwendeten Restriktionsenzyme wurden von Gibco BRL bezogen. Die jeweiligen Restriktionspuffer stammten vom Hersteller des entsprechenden Restriktionsenzyms. Tabelle 4: Bezugsquellenverzeichnis
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