Aufbauend auf Untersuchungen im 3'-Bereich des pEA9-nif-Clusters [Steibl, Dissertation (in Vorbereitung)] war es das Ziel der vorliegenden Diplomarbeit, das postulierte, neue IS-Element durch Sequenzierung genetisch zu charakterisieren und die mögliche Verbreitung in Enterobacter agglomerans 339, ggf. darüber hinaus, mittels DNA-DNA-Hybridisierungen zu untersuchen.

Für die Sequenzierung und Klonierung stand der Cosmidklon pHD54, der die vollständige nif-Region von pEA9 trägt [Steibl, 1989], und weitere Subklone, welche Restriktionsfragmente von pHD54 aus der 3'-flankierenden Region des nif-Clusters enthalten, zur Verfügung: Die Klonierung des 5.4 kb HindIII-BamHI-Fragmentes in die HindIII- und BamHI-Schnittstelle von pUC18 ergab den Klon pJJ5.4HB und durch Klonierung des 0.8 kb SalI-BamHI-Fragmentes in die entsprechenden Schnittstellen von pUC18 wurde pJJ0.8SB hergestellt [Steibl, Dissertation (in Vorbereitung)].

Die vollständige Sequenzierung des IS-Elementes wurde mit doppelsträngiger Plasmid-DNA nach der Methode von Sanger durchgeführt [Sanger et al., 1977]. Als Sequenziervektor wurde pUC18 verwendet, was die Sequenzierung beider DNA-Stränge eines Inserts durch Verwendung von zwei verschiedenen Primern ermöglichte.

Aus Sequenzdaten war bereits bekannt, daß das 0.8 kb SalI-BamHI-Fragment den Großteil des IS-Elementes trägt; auch einige Restriktionsschnittstellen waren schon in diesem Bereich kartiert [Steibl, Dissertation (in Vorbereitung)]. Doch um für die spätere Klonierung von Restriktionsfragmenten zur anschließenden Sequenzierung eventuell geeignetere Schnittstellen zu finden, wurde die bereits bestehende Restriktionskarte vom rechten Randbereich des pEA9-nif-Clusters durch eine Nachkartierung mit weiteren Restriktionsenzymen ergänzt und über den bisher kartierten Bereich hinaus erweitert. Im Vordergrund stand dabei die Suche nach Fragmenten, die möglichst große Teile des IS-Elementes tragen. Da es sich bei pHD54 um ein Plasmid von annähernd 47 kb handelte, dessen Restriktionsverdau eine unüberschaubare Vielzahl von Fragmenten ergeben hätte, mußten die in diesem Zusammenhang interessanten Restriktionsfragmente markiert werden. Diese Markierung zur vereinfachten Restriktionsanalyse erfolgte mittels Hybridisierung, was die Herstellung einer geeigneten DNA-Sonde erforderlich machte. Um eine gezielt 'IS3Ea9'-spezifische DNA-Sonde herzustellen, die sich auch für spätere Untersuchungen zur Bestimmung von Kopienzahl und Verbreitung wiederverwenden läßt, wurde Plasmid-DNA von pJJ0.8SB, der das 0.8 kb SalI-BamHI trägt, im Restriktionsverdau mit BamHI und SalI geschnitten und im Agarose-Gel elektrophoretisch aufgetrennt. Nach Elution des 0.8 kb SalI-BamHI-Fragmentes und entsprechender Aufreinigung erfolgte die Markierung mit Digoxigenin-11-dUTP, wie unter 3.10.2.1 beschrieben. Die Kontrolle der Konzentration markierter DNA erfolgte mit Dot Blot, wie unter 3.10.2.2 erläutert, und zeigte eine gute Ausbeute von 1 ng Dig-markierter DNA/µl 'Labeling'-Ansatz. Das entsprechend markierte 0.8 kb SalI-BamHI-Fragment aus pJJ0.8SB wurde im folgenden stets als 0.8 SB-Sonde bezeichnet.

Zur Kartierung wurde nun Plasmid-DNA von pHD54 mit verschiedenen Restriktions-enzymen in Einzel-und Doppelverdaus geschnitten. Der Verdau mit HpaI und SphI sollte dabei neue, noch nicht kartierte Schnittstellen aus dem 3'-Bereich von pEA9 zeigen, während das Restriktionsmuster mit PstI- und SalI-Verdaus zum einen den Anschluß an die bestehende Restriktionskarte von pHD54, zum anderen aber auch weitere Schnittstellen im noch nicht kartierten Bereich liefern sollte. Nach Auftrennung der pHD54-Restriktions-verdaus mittels Agarose-Gelelektrophorse und Übertragung auf eine Nylonmembran mittels Southern Blot, erfolgte die Hybridisierung des Filters mit der 0.8 SB-Sonde unter hoher Stringenz wie unter 3.10 beschrieben.

Das Ergebnis ist in Abbildung 5 dargestellt. Im Detail zeigten dabei folgende Restriktionsfragmente ein Hybridisierungssignal (in der Reihenfolge: Spur 1-9, Abb.5): 1.9 kb PstI/HpaI, 3.9 kb PstI, 0.9 kb PstI/SphI, 3.8 kb SphI, 3.5 kb SphI/HpaI, 4.5 kb HpaI, 2.0 kb HpaI/SalI, 6.5 kb SalI und 1.0 kb SalI/SphI.

Die Auswertung dieses Restriktions- bzw. Hybridisierungsmusters ermöglichte zunächst die Kartierung von drei neuen Restriktionsschnittstellen im 3'-Bereich des pEA9-nif-Clusters: Zum einen befinden sich im 1.4 kb BamHI-Fragment von pHD54 eine HpaI- und SphI-Schnittstelle in asymmetrischer Anordnung, wobei die SphI-Schnittstelle im Abstand von ca. 0.8 kb in 5'-Richtung von der HpaI-Schnittstelle liegt. Desweiteren konnte auf dem 5.9 kb BamHI-Fragment eine weitere SphI-Schnittstelle zwischen der kartierten HindIII- und HpaI-Schnittstelle im Abstand von 0.4 kb zur HpaI-Schnittstelle nachgewiesen werden. Durch die Größe der hybridisierenden SalI- und PstI-Fragmente konnte außerdem die Orientierung des 42.4 kb-Inserts im pHD54 bestimmt werden, da die im 3'-Bereich gefundene PstI- und SalI-Schnittstelle bereits außerhalb des pEA9-Inserts im pJA1-Vektor kartierte. Die erweiterte Plasmidkarte von pHD54 ist in Abbildung 6 dargestellt.

Abbildung 5: Restriktionsverdau von pHD54 mit Hybridisierungsergebnis

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Abbildung 6: Detailausschnitt der Plasmidkarte von pHD54

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Der pHD54-SphI-Restriktionsverdau zeigte im Agarose-Gel bei 3.8 kb eine potentielle Doppelbande (Abb.5, Spur 4, mit Pfeil markiert), was zunächst nur anhand der Leuchtintensität dieser Bande im UV-Licht auffiel: Es bestand die Möglichkeit, daß an dieser Stelle bei 3.8 kb zwei Fragmente gleicher Größe im Gel laufen. Da dieses SphI-Fragment für eine spätere Klonierung interessant war, wurde die Möglichkeit einer Doppelbande genauer untersucht. Den Nachweis sollte ein Vergleich mit pHD21 erbringen: Die klonierten pEA9-Inserts von pHD54 und pHD21 überlappen in einem Bereich von 35.1kb, jedoch fehlt pHD21 der Randbereich von pHD54 mit dem 5.9 und 1.4 kb-BamHI-Fragment und damit auch das 3.8 kb SphI-Fragment A im IS-homologen Bereich. Existierten tatsächlich zwei 3.8 kb SphI-Fragmente, so wird Fragment B bei pHD54 durch A 'überdeckt', während B bei pHD21 sichtbar sein mußte. Nach Restriktionsverdau von pHD54 und pHD21 mit SphI und elektrophoretischer Auftrennung zeigte pHD21 im Gegensatz zu pHD54 keine 3.8 kb SphI-Doppelbande (Ergebnis nicht abgebildet), womit die Existenz von zwei SphI-Fragmenten gleicher Größe auf pHD54 nachgewiesen war.

Klonierungsstrategie

Mit den Ergebnissen der Ansequenzierung von pJJ0.8SB stand fest, daß Teile des IS-Elementes, bei einer vergleichbaren Größe der IS3-Elemente von etwa 1.2 kb, sowohl in 5'-Richtung von der SalI-Schnittstelle, als auch in 3'-Richtung von der BamHI-Schnittstelle liegen mußten [Steibl, Dissertation (in Vorbereitung)]. Damit erstreckte sich das postulierte IS-Element über den im pJJ5.4HB subklonierten Bereich auf das 1.4 kb BamHI-Fragment hinaus. Die Herstellung von Deletionsklonen des pJJ5.4HB, die Klonierung des 1.4 kb BamHI-Fragmentes aus pHD54 mit anschließender Sequenzierung würde somit die vollständige Sequenz im Einzelstrang liefern.

Ausgehend von der erweiterten Restriktionskarte des pHD54 bot sich für die Sequenzierung des Gegenstranges die Klonierung des 3.8 kb SphI-Fragmentes an. Eine Übersicht der Klonierungsstrategie ist in Abbildung 7 wiedergegeben.

Abbildung 7: Übersicht der Klonierungsstrategie

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4.2.1 Herstellung der Deletionsklone von pJJ5.4HB

Um den IS-homologen Bereich auf pJJ5.4HB vollständig zu sequenzieren, wurde dieses Plasmid einer ExonukleaseIII-Behandlung unterzogen.

PJJ5.4HB Plasmid-DNA wurde mit BamHI und SstI als Schutzgruppe geschnitten; anschließend erfolgte die ExonukleaseIII-Behandlung wie unter 3.4.3 beschrieben. Dabei wurde das 5.4 kb HindIII-BamHI-Insert von der BamHI-Seite abgebaut, was die erwünschten Insertdeletionen erzeugte (Abb. 8 u. 9). Nach Transformation der ligierten Reaktionsansätze verschiedener Zeitstufen in E.coliDH5a-Zellen wurden die jeweiligen Transformationsansätze auf LB-Ap-Medien ausplattiert. Von den etwa 20 Transformanten je Platte wurden pro Zeitwert fünf Klone ausgewählt. Plasmid-DNA dieser ausgewählten Transformanten wurde mit HindIII linearisiert und gelelektrophoretisch auf die Deletionsgröße überprüft. Von den insgesamt 50 Klonen wurden letztlich fünf, welche Deletionen im Bereich von 0.2 bis 1.0 kb zeigten, ausgewählt und für die spätere Sequenzierung verwendet.

Die Klone wurden entsprechend ihrer Deletionsgröße als pJJ5.4HD0.2, pJJ5.4HD0.35, pJJ5.4HD0.4, pJJ5.4HD0.7 und pJJ5.4HD1.0 bezeichnet (Abb 8 u. 9).

Abbildung 8: ExonukleaseIII-Abbau von pJJ5.4HB

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Abbildung 9: Restriktionsverdau von pJJ5.4HB und Deletionsklonen

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4.2.2 Herstellung von pJJ1.4B

Zunächst wurde pUC18-DNA mit BamHI linearisiert und stand nach Dephoshorylierung als Vektor für die anschließende Klonierung zur Verfügung. Zur Präparation des späteren Inserts wurde pHD54-DNA mit BamHI geschnitten und gelelektrophoretisch aufgetrennt. Nach Elution und Aufreinigung des 1.4 kb BamHI-Fragmentes erfolgte die Ligation mit dem vorbereiteten pUC18-Vektor (Schema der Klonierung in Abb.10).

Abbildung 10: Klonierung von pJJ1.4B

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Der Ligationsansatz wurde anschließend in E.coliDH5a-Zellen transformiert und zur a-Komplementation auf LB-Ap-Platten mit IPTG-/XGal-Zusatz ausplattiert. Von den 20 lacZ--Transformanten wurden zehn ausgewählt, die durch Restriktionsverdau mit BamHI auf das Vorhandensein des erwarteten 1.4 kb BamHI-Inserts gescreent wurden. Von den acht Klonen, die ein entsprechendes Insert zeigten, wurde einer für die spätere Sequenzierung ausgewählt und als pJJ1.4B bezeichnet. Zunächst wurde der ausgewählte Klon jedoch einer detaillierten Restriktionskartierung unterzogen (Abb.11):

Durch Restriktionsverdau von pHD54 und pJJ1.4B mit BamHI ließ sich in beiden Fällen das identische 1.4 kb Fragment zeigen. Als zweite Bande zeigte pJJ1.4B die erwartete 2.7 kb Vektor-Bande des pUC18. Durch Restriktionsverdau mit HpaI und SphI sollte die Anzahl und der Abstand entsprechender Schnittstellen im pJJ1.4B bestimmt werden, da gerade diese Schnittstellen unter 4.1 im pHD54 kartiert wurden. DNA von pJJ1.4B wurde ungeschnitten und im Restriktionsverdau mit beiden Enzymen im Einzel- und Doppelverdau im Gel aufgetrennt. Der HpaI-Verdau ergab ein 4 kb Fragment und damit eine Linearisierung des Plasmides, zeigte also nur eine Schnittstelle. Da jedoch im pUC18 keine HpaI-Schnittstelle vorkommt, mußte diese im Insert liegen. Der Verdau mit SphI ergab Fragmente von 2.9 und 1.2 kb und damit auch zwei Schnittstellen im pJJ1.4B, von denen eine in der 'Polycloning-Site' des pUC18 liegt. Im Doppelverdau mit HpaI und SphI zeigten sich Banden bei 2.9, 0.9 und 0.26 kb, d.h., das 1.2 kb SphI-Fragment wurde durch HpaI in ein 0.9 und 0.26 kb Fragment geschnitten.

Zur Bestätigung der Orientierung des Inserts im pJJ1.4B wurde der Abstand der HpaI-Schnittstelle zur externen EcoRI-und HindIII-Schnittstelle im Vektor bestimmt. Der Doppelverdau mit HpaI und EcoRI zeigte ein 2.9 und 1.3 kb Fragment. Restriktionsverdau mit HpaI und HindIII ergab dagegen ein 3.8 und 0.28 kb Fragment. Damit stand die Orientierung fest: Die HpaI- liegt dicht zur HindIII-Schnittstelle im pUC18, während die SphI-Schnittstelle im Abstand von ca. 0.9 kb zur HpaI- in Richtung der EcoRI-Schnittstelle des Vektors liegt. Um nachzuweisen, daß das 1.4 kb BamHI-Fragment identisch zu dem im pJJ1.4B ist, wurden beide Plasmide in Doppelverdaus mit BamHI/HpaI, BamHI/SphI und einmal pHD54 nur mit BamHI (zur besseren Übersicht im Gel) geschnitten. Im BamHI/HpaI-Verdau zeigten sich für beide Plasmide die jeweils gleichen Banden bei 1.2 und 0.26 kb; die BamHI/SphI-Verdaus beider Plasmide ergaben die identischen Banden bei 0.22 und 1.2 kb. Das Ergebnis belegte eindeutig, daß das 1.4 kb Insert im pJJ1.4B dem 1.4 kb BamHI-Fragment von pHD54 entspricht.

Das vollständige Ergebnis der Restriktionskartierung wurde in Abbildung 11, die abgeleitete Plasmidkarte von pJJ1.4B bereits in Abbildung 10 dargestellt.

Abbildung 11: Restriktionskartierung von pJJ1.4B

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4.2.3 Herstellung von pJJ3.8SphA

Zur Sequenzierung des Gegenstranges im Übergangsbereich der Subklone pJJ5.4HB und pJJ1.4B wurde das 3.8 kb SphI-Fragment, welches bei der Kartierung des pHD54 ein Hybridisierungssignal gab, in die SphI-Schnittstelle von pUC18 kloniert.

Zur Klonierung wurde pUC18-DNA durch Restriktionsverdau mit SphI und anschließende Dephosphorylierung als Vektor vorbereitet. Für die Präparation des 3.8 kb SphI-Inserts zeigte sich allerdings das Problem zweier gleich großer SphI-Fragmente im pHD54. Für die Klonierung bedeutete dies praktisch, zunächst das 3.8 kb 'SphI-Fragmentgemisch' zu klonieren und später auf den gesuchten Klon mit dem gewünschten SphI-Fragment zu screenen.

Abbildung 12: Klonierung des pJJ3.8SphA

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Ein Restriktionsverdau von pHD54 mit SphI wurde im Agarose-Gel aufgetrennt, die 3.8 kb SphI-Doppelbande eluiert, das 'Fragmentgemisch' mit dem vorbereiteten pUC18 Vektor ligiert und in E.coliDH5a-Zellen transformiert. Der Transformationsansatz wurde auf LB-Ap-Platten mit IPTG-/X-Gal-Zusatz ausplattiert. Von zehn weißen lacZ--Kolonien wurde Plasmid-DNA gewonnen, mittels Dot Blot auf eine Nylonmembran übertragen und mit der 0.8 SB-Sonde hybridisiert. Von den vier Klonen, die ein Hybridisierungssignal gaben, wurde einer ausgewählt und als pJJ3.8SphA bezeichnet. Von den sechs Klonen, die kein Hybridisierungssignal zeigten, wurden zwei aufbewahrt, jedoch nicht weiter untersucht. Sie wurden als pJJ3.8SphB bezeichnet. Im Anschluß erfolgte eine Restriktionskartierung von pJJ3.8SphA (Abb. 13).

Das Restriktionsmuster zeigt im SphI-Verdau von pJJ3.8SphA und pHD54 das klonierte 3.8 kb Fragment. Im SalI-Verdau von pJJ3.8SphA konnte durch ein 3.8 kb Fragment die Orientierung des Inserts im Vektor bestimmt werden, denn diese 3.8 kb müssen sich aus den Einzelgrößen von pUC18 (2.7 kb) und dem kartierten SalI-SphI-Fragment (1 kb; beschrieben unter 4.1) zusammensetzen. Die Fragmentengrößen im BamHI-Verdau von pJJ3.8SphA zeigten Abstände von 3.0 kb bzw. 3.5 kb für die zwei BamHI-Schnittstellen. Da eine davon an bekannter Stelle im Vektor liegt, mußte die zweite im Insert im Abstand von 3.5 kb zur ersten liegen. Damit stand die Orientierung des Inserts fest und das entsprechende Kartierungsergebnis ist in Abbildung 12 dargestellt.

Der hergestellte Klon pJJ3.8SphA ist für weitere Untersuchungen an 'IS3Ea9' interessant, da nun erstmals das vollständige IS-Element in einem Vektor subkloniert vorliegt.

Abbildung 13: Restriktionskartierung von pJJ3.8SphA

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Spur 1: KBL Spur 4: pJJ3.8SphA + SphI
Spur 2: pJJ3.8SphA + BamHI Spur 5: pHD54 + SphI
Spur 3: pJJ3.8SphA + SalI Spur 6: KBL

Aus Literaturangaben war bekannt, daß sich ORFA von IS-Elementen als DNA-bindendes Protein durch einen stark basischen Charakter auszeichnet, was sich in einem stark basischen isoelektrischen Punkt (pI) niederschlägt [Machida et al., 1982; Prentki et al., 1987a; Polard et al., 1991]. Das dem ORFA bei IS1 entsprechende Protein weist einen pI=10.9 auf [Galas u. Chandler, 1989].

Da in der jeweiligen Referenzliteratur konkrete Zahlenangaben für die IS3-Familie fehlten, wurde mit Hilfe des GCG-Programms ISOELECTRIC für die oben aufgeführten IS3-Elemente der pI von ORFA bestimmt und es zeigten sich vergleichbar basische Werte; beispielsweise hat ORFA von IS911 einen isoelektrischen Punkt von pI=10.6.

Die Untersuchung der Zusammensetzung des ORFA von 'IS3Ea9' wurde ebenfalls mit Hilfe des GCG-Programms ISOELECTRIC durchgeführt. Das Ergebnis ist in Abbildung 19 dargestellt.

Es zeigte sich auch hier ein basischer isoelektrischer Punkt von pI=10.4, was auf eine positve Nettoladung in einem neutralen (pH 7) Milieu hinweist und ebenfalls DNA-bindende Eigenschaften für ORFA nahelegt. Vergleichbare Zahlenwerte finden sich, abgesehen von IS-kodierten Proteinen, bei Prokaryonten sonst nur bei histonartigen Proteinen (wie HU) oder IHF, deren DNA-Bindungseigenschaften nachgewiesen sind.

Abbildung 19: Abgeleitete Titrationkurve des ORFA von 'IS3Ea9'

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Um konkrete Homologien auf AS-Ebene mit dem ORFA anderer IS-Elemente zu finden wurde ein multiples Alignment mit dem jeweiligen ORFA von IS407, IS476, ISR1, IS3, IS3411, IS911, IS861 und IS150 unter Verwendung des HUSAR-Programms TREE durchgeführt. Der Algorithmus dieses Programm berücksichtigt im Vergleich zu herkömmlichen Programmen zum Alignment von DNA- und AS-Sequenzen verstärkt Evolutionsprinzipien, wie z.B. den Grundsatz 'einmal eine Lücke, immer eine Lücke', was für eine spätere Stammbaumerstellung von Bedeutung ist [Feng u. Doolittle, 1987]. Das resultierende Alignment ist in Abbildung 20 dargestellt. Der Vergleich der AS-Sequenzen von ORFA zeigt in großen Bereichen eine hohe Konservierung, was auf das Vorhandensein von funktionell wichtigen Domänen schließen läßt. Insgesamt beträgt die Sequenzhomologie bei den aufgeführten IS-Elementen auf AS-Ebene jedoch nur 30-65 %. Bereits der visuelle Vergleich der AS-Sequenzen von ORFA zeigt, daß sich innerhalb der IS3-Familie Untergruppen hoher Sequenzhomologie bilden.

Abbildung 20: Multiples Alignment von ORFA

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10 20 30 40 50 60 70

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In der Referenzliteratur für die genannten IS-Elemente wird als ein funktioneller Bereich ein Helix-Turn-Helix-Motiv im ORFA beschrieben, ein charakeristisches Merkmal für Proteine mit DNA-Bindungseigenschaften. Um festzustellen, ob sich im ORFA von 'IS3Ea9' ebenfalls ein solches Motiv befindet, wurde die AS-Folge von ORFA anhand von Kalkulationstabellen [Dodd u. Egan, 1987], wie unter 3.9.4 beschrieben, untersucht. Ein Vergleich der postulierten Helix-Turn-Helix-Motive ist in Tabelle 12 aufgeführt.

Tabelle 12: Potentielle Helix-Turn-Helix-Motive im ORFA bei IS3-Elementen

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Der resultierende 'Score'-Wert bestätigte im Vergleich mit anderen IS-Elementen (Tab.12) das Vorhandensein der gesuchten Sekundärstruktur, wonach sich demnach auch im ORFA von 'IS3Ea9' von Aminosäure 23 bis 43 mit hoher Wahrscheinlichkeit ein Helix-Turn-Helix-Motiv befindet.

4.4.3 ORFB

Analog den Verhältnissen zur Nomenklatur bei ORFA von IS3-Elementen, wird das große offene Leseraster am ß-Terminus des IS-Elementes, welches in Relation zu orfA in Phase -1 kodiert, als orfB und das Genprodukt als ORFB bezeichnet. Die Definition, welches offene Leseraster aus der Erstbeschreibung im folgenden als ORFB angesprochen wird, wurde in Tabelle 13 aufgeführt. Das ORFB von 'IS3Ea9' erstreckt sich von Nukleotid 754 bis 1582 und kodiert für 276 aa.

Tabelle 13: Erläuterung zur Bezeichnung 'ORFB'

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Auch für ORFB war nach Literaturangaben ein basischer Charakter zu erwarten. Da auch hier, wie bei ORFA, konkrete Zahlenwerte zum Vergleich mit ORFB von 'IS3Ea9' fehlten, wurde zunächst für die ORFB-Proteine verschiedener IS3-Elemente der isoelektrische Punkt mit Hilfe des GCG-Programms ISOELECTRIC bestimmt. Es zeigte sich in allen Fällen ein dem ORFA vergleichbar basischer pI; für ORFB von IS911 wurde beispielsweise ein isoelektrischer Punkt von pI=10.8 ermittelt.

Zur Abschätzung der Eigenschaften des ORFB von 'IS3Ea9' wurde ebenfalls das GCG-Programm ISOELECTRIC verwendet. Das Ergebnis ist in Abbildung 21 dargestellt. Vergleichbar mit ORFA hat auch ORFB einen auffällig basischen pI von 10.3.

Abbildung 21: Abgeleitete Titrationskurve des ORFB von 'IS3Ea9'

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Um festzustellen, ob ORFB von 'IS3Ea9' ein hohes Maß an Homolgie zum ORFB anderer IS3-Elemente zeigt, wurden die jeweiligen AS-Sequenzen von IS407, IS476, ISR1, IS3, IS3411, IS911, IS861, IS150 und 'IS3Ea9' mit Hilfe des HUSAR-Programms TREE [vgl. Anmerkung unter 4.4.2; Feng u. Doolittle, 1987] in einem multiplen Alignment zusammengestellt (Abb.22).

Abbildung 22: Multiples Alignment von ORFB

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Vergleichbar mit ORFA zeigten sich auch bei ORFB, mit Ausnahme des Bereiches der ersten 70 AS, Regionen hoher Konservierung auf AS-Ebene, was auf das Vorhandensein funktionell wichtiger und insofern konservierter Domänen schließen läßt.

In der Literatur werden an dieser Stelle des öfteren Homologievergleiche von IS-kodierten mit retroviralen Genen aufgeführt [Chandler u. Fayet, 1993]. Konkret wurden Homologien zu einer funktionellen Domäne der Intergrase von Retroviren für IS911 beschrieben [Khan et al., 1991].

Datenbankrecherchen mit ORFB von 'IS3Ea9' ergaben zunächst kein eindeutiges Ergebnis. Erst nach gezieltem Alignment des ORFB von 'IS3Ea9' mit der Sequenz der Integrase eines endogenen Retrovirus der Maus (MIn) wurde in einem Bereich von 74 aa eine mäßige Übereinstimmung von 23 % Identität festgestellt (Abb.23). ORFB von IS911 zeigte beim Alignment mit der MIn-Sequenz eine vergleichbar geringe Homologie (Ergebnis nicht abgebildet).

Abbildung 23: Alignment von 'IS3Ea9' ORFB und MIn

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Über die Funktion und Eigenschaften von ORFB ist wenig bekannt. Lediglich die basische Nettoladung des Proteins deutet auf DNA-Bindungseigenschaften. Ausgehend von Sequenzhomologien im ORFB zur Integrase von Retroviren ließe sich über funktionelle Gemeinsamkeiten spekulieren, schließlich verfügt das retrovirale Protein über die Funktion der Incision, Integration und Religation von DNA - alles Eigenschaften, die auch für die Transposase von IS-Elementen gefordert werden [Fayet et al., 1990; Khan et al., 1991; Polard et al., 1991].

4.4.4 ORFC

Das gefundene offene Leseraster orfC liegt im Bereich von Position 988-1230 auf dem Gegenstrang zu orfA und orfB. Eine 'upstream' liegende Promotorstruktur mit Homologie zum s70-Promotor von E.coli wurde zwischen den Nukleotiden 1269 und 1308 beschrieben, jedoch zeigte die vermutete Shine-Dalgarno-Sequenz nur eine geringe Homologie zur SD-Consensus-Sequenz. Eine Translation von orfC wäre demnach unwahrscheinlich.

Ein Vergleich mit IS-Elementen der IS3-Familie zeigte, daß das jeweilige Leseraster auf dem Gegenstrang, relativ zu orfA und orfB, ohne weitere Bedeutung für die Funktion und Effizienz der Transposition ist. Da auch innerhalb dieser IS-Gruppe keine Konservierung in Bezug auf Größe und Lage festzustellen war, wurde orfC im weiteren nicht näher charakterisiert.

4.4.5 Motive für ribosomales 'Frameshifting'

Die Gruppe der IS3-Elemente zeichnet sich neben ihrer weiten Verbreitung nicht allein durch die Struktur der offenen Leseraster orfA und orfB in Phase 0 und -1, sondern auch durch Übereinstimmungen in vielen charakteristischen Merkmalen mit einer weiteren großen Gruppe transponierbarer Elemente aus - den Retroviren [Fayet et al., 1990]. Die Sequenz der IR ist den retroviralen LTRs (Long Terminal Repeats) äußerst ähnlich. Insbesondere die terminalen Dinukleotide 5'-TG...CA-3' sind bei IS3-Elementen und Retroviren zu 100 % konserviert [Skalka, 1988]. Desweiteren zeigt der ORFB der IS3-Elemente, wie bereits unter 4.4.3 erwähnt, Homologien zu einer hochkonservierten Region in retroviralen Integraseproteinen [Fayet et al., 1990; Khan et al., 1991]. Inzwischen wird eine weitere Übereinstimmung beider Gruppen postuliert, wonach IS3-Elemente ihre Transposase durch einen Mechanismus bilden, der ein ribosomales 'Frameshifting' von Phase 0 nach -1 beinhaltet [Polard et al., 1991].

Nachgewiesen war dieser Mechanismus für die gag-pol-Gene vieler Retroviren [Jacks et al., 1988; Weiss et al., 1990]. Inzwischen wurde dieses Prinzip jedoch auch für IS-Elemente belegt: Bei IS1 bilden insA und insB ein InsAB-Fusionsprotein mittels ribosomalem 'Frameshifting' [Sekine u. Ohtsubo, 1989]. Bei IS3-Elementen erfolgte der Nachweis des 'Frameshifting' für IS911 [Polard et al., 1991] und IS150 [Vögele et al., 1991]. In diesem Zusammenhang wurden zwei strukturelle Mechanismen, sogenannte 'Frameshift-Fenster', postuliert: Typ I beinhaltet ein Hepta-nukleotid-'Frameshift-Fenster' der allgemeinen Form Y YYX XXZ (Phase 0), bzw. YYY XXX Z (Phase -1), das am häufigsten anzutreffen ist. Die Sequenz A AAA AAG, die bei vielen Retroviren und IS-Elementen, aber auch im dnaX-Gen von E.coli vorzufinden ist, bildet dabei das effizienteste 'Frameshift-Fenster' mit einer 'Frameshifting'-Frequenz von ca. 90 % [Atkins, zitiert in Chandler u. Fayet, 1993]. Ein wesentlicher Anteil an dieser hohen Effizienz kommt dabei dem AAG-Codon zu, da E.coli das entsprechende CUU-tRNA-Anticodon fehlt [Tsuchihashi u. Brown, 1992]. 'Frameshifting' des Ribosoms nach Typ II mit einer vielfach reduzierten Effizienz beinhaltet ein kurzes Sequenzmotiv meist vier identischer Basen der allgemeinen Form X XXX oder X XXZ (Phase 0), bzw. XXX Z (Phase -1). Notwendige Voraussetzung ist allerdings ein kurz darauf folgendes Stoppcodon [Weiss et al., 1990]. Trotz der dabei entstehenden Fehlpaarungen bei der Codon-Anticodon-Paarung der tRNA konnte ribosomales 'Frameshifting' im Gen10 des Phagen T7 nachgewiesen werden [Condron, zitiert in Chandler u. Fayet, 1993].

Potentielle 'Frameshift-Fenster' vom Typ I und -II sind für einige IS-Elemente in Tabelle 14 aufgelistet.

Tabelle 14: Potentielle 'Frameshift-Fenster' bei IS-Elementen

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Eine Modulation der 'Frameshift'-Effizienz wurde für verschiedene weitere Faktoren belegt. So bewirken Sekundärstrukturen der mRNA, wie Haarnadelschleifen [Jacks et al., 1988] oder Pseudoknoten, d.h., weitere Faltungen der Haarnadelschleifen, eine erhöhte 'Frameshift'-Frequenz [Tu, zitiert in Chandler u. Fayet, 1993; Tzy-Hwa et al., 1992]. Die gleiche Wirkung haben 'upstream' gelegene Ribosomen-Bindestellen vom Typ der Shine-Dalgarno-Sequenz [Prère, zitiert in Polard et al., 1991]. Als allgemein gültiges Prinzip ließe sich formulieren, daß sämtliche Faktoren, die die Wanderungsgeschwindigkeit des Ribosoms auf der mRNA herabsetzen, gleichzeitig die 'Frameshifting'-Frequenz erhöhen [Chandler u. Fayet, 1993]. Dementsprechend konnte gezeigt werden, daß die Bindung spezifischer Proteine an die mRNA ebenso wie die Verwendung seltener Codons das 'Frameshifting' stimuliert [Dix, 1990].

Von den 23 zur Zeit bekannten Vertretern der IS3-Familie weisen 11 IS-Elemente ein Typ I -Heptanukleotid-'Frameshift-Fenster' auf. Bei IS3, IS3411 und IS476 liegt ein potentielles Typ II -Motiv vor, wobei IS3411 dieses Motiv gleich zweimal aufweist.

In 'IS3Ea9' befindet sich am 3'-Ende des orfA das Sequenzmotiv A AAG -3-TGA, begleitet von einem 'Inverted Repeat', das auf mRNA-Ebene zur Ausbildung von haarnadelschleifen-förmigen Sekundärstrukturen führen könnte. Unter Verwendung des GCG-Programms FOLD/SQUIGGLES wurde für die Sequenzbereiche des möglichen 'Frameshift-Fensters' von 'IS3Ea9' und des bereits nachgewiesenen Fenster von IS911 die mögliche Faltung einer mRNA bestimmt. Für 'IS3Ea9' ist das Ergebnis in Abbildung 24 dargestellt. Die mRNA-Faltung für IS911 zeigte eine zu 'IS3Ea9' vergleichbare Haarnadelschleifenform (nicht abgebildet), die auch den in der Literatur angegeben Strukturen entsprach [Chandler u. Fayet, 1993].

Abbildung 24: Eine der möglichen mRNA-Strukturen im Bereich des 'IS3Ea9'-Frameshift-Fensters

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An der mRNA-Struktur im Bereich des 'Frameshift-Fensters' ist bemerkenswert, daß sämtliche für ein 'Frameshifting' notwendige Faktoren, wie (1) das 'Frameshift-Fenster', (2) das UGA-Stoppcodon und (3) die Shine-Dalgarno-Sequenz in schlecht oder ungepaarten Bereichen, d.h., an exponierter Stelle, vorkommen. Die UGA-Sequenz liegt wie bei IS150 und IS911 in der großen Schleife der Haarnadelstruktur [Polard et al., 1991; Chandler u. Fayet, 1993].

Da orfA und orfB jeweils in Phase 0 bzw -1 kodieren, die Position eines potentiellen 'Frameshift-Fensters' festgestellt wurde und insgesamt eine hohe Homologie zu IS3-Elementen nachgewiesen wurde, bestand die Möglichkeit, daß auch bei 'IS3Ea9' durch ribosomales 'Frameshifting' ein ORFAB-Fusionsprotein gebildet wird, das, wie für IS911 nachgewiesen, die aktive Transposase darstellt [Prère et al., 1990; Chandler u. Fayet, 1993]. Handelt es sich bei der Region zwischen orfA und orfB um eine intergenische Region im klassischen Sinne, so wird dieser Bereich nicht transkribiert und infolgedessen auch keiner Selektion unterworfen. Ein Vergleich dieser Übergangsbereiche zwischen orfA und orfB von verschiedenen IS3-Elementen dürfte demnach keine konservierten Bereiche aufweisen. Um dies im vorliegenden Fall zu überprüfen, wurden potentielle ORFAB-Fusionsproteine in einem multiplen Alignment verglichen, wobei ein Rasterschub am Ende von orfA von Phase 0 nach -1 am angegebenen 'Frameshift-Fenster' angenommen wurde (vgl. Tab.14). Das Alignment wurde mit Hilfe des HUSAR-Programms TREE [vgl. Anmerkung unter 4.4.2; Feng u. Doolittle, 1987] erstellt und ist unter Abbildung 25 aufgeführt. Der jeweilige orfA-B-Übergangsbereich wurde hervorgehoben.

Abbildung 25: Multiples Alignment potentieller ORFAB Fusionsproteine

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Abbildung 25 zeigte trotz der unterschiedlichen Größe der jeweiligen Übergangsbereiche eine Konservierung in der AS-Sequenz. 'IS3Ea9' weist in dieser Region Homologien zu den Übergangsbereichen von IS407, IS476 und ISR1 auf. Bei IS407 ist dieser extrem große Abschnitt über weite Bereiche homolog zum ORFB der aufgeführten IS3-Elemente. Es wurde nun auch verständlich, warum das Alignment der ORFB-Proteine im Bereich des N-Terminus eine geringere Homologie zeigte (s.u. 4.4.3), denn für ein korrektes Alignment von ORFB sind anscheinend die zusätzlichen AS der ORFA-ORFB-Übergangsbereiche notwendig.

Zwar ließen sich für diesen Übergangsbereich keine Homologien zu typischen 'Linker'-Sequenzen (meint: 'Linker' als Koppler funktioneller Untereinheiten in multimeren Proteinen) finden, doch erscheint das Ergebnis des obigen Alignments als ein schlüssiger Beleg für ein ribosomales 'Frameshifting' und die Bildung von Fusionsproteinen.

4.4.6 Sequenzhomologie zu Virulenzplasmid pIB1 von Yersinia pseudotuberculosis

Bei Datenbankrecherchen mit der AS-Sequenz von ORFB, die zum einen die hohe Homolgie zu IS-Elementen der IS3-Familie ergaben, zeigte sich ebenfalls ein hohes Maß an Übereinstimmung mit einem sequenzierten Bereich von Plasmid pIB1, das in Yersinia pseudotuberculosis für dessen Virulenzeigenschaften verantwortlich gemacht wurde [Krause et al., 1990 u. 1991].

Ein Alignment der DNA-Sequenz von 'IS3Ea9' mit der Sequenz des 1.6 kb BamHI-PstI-Fragments von pIB1 ['Accession-Number' in der EMBL/Genbank Datenbank: M58506] zeigte 61 % Identität in einem Bereich von 300 bp. Die weitere Auswertung in diesem homologen Bereich der pIB1-Sequenz ergab ein offenes Leseraster von Position 1332 bis 1631 mit 101 aa, das von auswärts in die Sequenz hereinläuft und im folgenden als orfYpb bezeichnet wurde. Im Bereich von Position 1297-1320 konnte eine hohe Ähnlichkeit zum rechten 'Inverted Repeat' von IS3-Elementen gefunden werden. Ein Homologievergleich dieser Sequenz mit der IR-Consensus-Sequenz und von ORFB der IS3-Elemente mit ORFYpb, dem potentiellen orfYpb-Translationprodukt, ist in Tabelle 15 abgebildet.

Tabelle 15: Homologievergleich von 'Inverted Repeats' und ORFB von IS3-Elementen mit pIB1

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Basenfolge

pIB1 1.6 kb BamHI-PstI-Fragment 1297- TGATCCCTCCCCAATATCCGTACC -1320

||| | |||| || |

Consensus-Sequenz TGA-CTG-CCCC--------TAGC

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Nach Tabelle 15 zeigte ORFYpb die höchste Homologie zu IS407 und 'IS3Ea9'; die mittlere Homologie zum ORFB der aufgeführten IS3-Elemente beträgt 50 %; dieser Wert entspricht auch den Verhältnissen innerhalb der IS3-Familie. Aufgrund der vorliegenden Auswertungen ist zu vermuten, daß in der angegebenen DNA-Sequenz von Plasmid pIB1 ein noch nicht beschriebenes IS-Element der IS3-Familie ansequenziert wurde. Eine Übersicht der Homologieverhältnisse ist in Abbildung 26 dargestellt.

Abbildung 28: Struktur eines möglichen IS3-Elementes auf pIB1 bei Yersinia pseudotuberculosis

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Nach Literaturangaben [Krause et al., 1990 u. 1991] liegt auf pIB1 in einer Länge von 200 bp (Position 1096-1300) ein zu IS630 homologer Bereich. Auf einem weiteren Virulenzplasmid, pSDL2 von Salmonella dublin, das nach DNA-DNA-Hybridisierungen in weiten Bereichen Homologien zu pIB1 aufwies, konnte an der gleichen Stelle ein vollständiges IS-Element mit Homologie zu IS630 gefunden werden. Bisher konnte für den Abbruch der Homologie auf pIB1 an Position 1300 keine Erklärung gefunden werden [Krause et al., 1990]. Da die Sequenz vom IS630-homologen IS-Element bei pIB1 um die Position 1300 abbricht, an Position 1297 jedoch, wie oben gezeigt, das IS-Element mit Ähnlichkeit zur IS3-Familie beginnt, besteht die Möglichkeit, daß dieses IS3-homologe IS-Element auf pIB1 in das IS630-homologe IS-Element inseriert hat. Mit der Arbeitsgruppe, die Bereiche des pIB1 sequenziert hat, wird Kontakt aufgenommen, da es von Interesse wäre zu erfahren, ob das zum 1.6 kb BamHI/PstI benachbarte PstI-Fragment von pIB1 sequenziert wurde, weil sich dann zeigen müßte, ob sich auf pIB1 das vollständiges IS3-Element befindet.

4.4.7 Phylogenetische Zuordnung von 'IS3Ea9' in die IS3-Familie

Aufgrund der Homologie in Bezug auf charakteristische Strukturmerkmale, signifikante Sequenzhomologien auf DNA- und AS-Ebene konnte das IS-Element 'IS3Ea9' der Verwandtschaftsgruppe der IS3-Familie zugeordnet werden. Um die phylogenetische Stellung innerhalb dieser Familie zu bestimmen, wurden für einige IS3-Elemente, darunter auch 'IS3Ea9', die jeweiligen Verwandtschaftsbeziehungen für die graphische Darstellung in Form eines Dendrogramms ermittelt.

Unter Verwendung des HUSAR-Programms TREE [Feng u. Doolittle, 1987] wurden zunächst die AS-Sequenzen der ORFAB-Fusionsproteine in einem multiplen Alignment zusammengestellt. Zu diesem Sequenzvergleich wurden anstelle von ORFA bzw. ORFB die ORFAB-Fusionsproteine verwendet (vgl. unter 4.4.5), da auf diese Weise der gesamte kodierende Bereich für die spätere Ermittlung der jeweiligen Verwandtschaftsbeziehung mit einbezogen wurde. Basierend auf diesem Sequenzalignment entwickelte das obige Computer-Programm TREE das in Abbildung 27 dargestellte Dendrogramm.

Abbildung 27: Stammbaum einiger ausgewählter IS3-Elemente

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Das Dendrogramm in Abbildung 27 zeigt, daß es sich bei der IS3-Familie um keine homogene Gruppe handelt, sondern daß sich weitere Untergruppen hoher Sequenzhomologie bilden. Beispielsweise steht 'IS3Ea9' zusammen mit den IS-Elementen IS407, IS476 und ISR1 in einer derartigen 'Unterfamilie'. Auch das unter 4.4.6 postulierte IS-Element bei Yersinia pseudotuberculosis zeigte zu IS407 die höchste Homologie und wäre dementsprechend in dieselbe 'Unterfamilie' einzuordnen.

Ein Vergleich, ob die gefundenen Verwandtschaftsbeziehungen mit den Verwandtschafts-verhältnissen der jeweiligen Wirtsorganismen korreliert ist, zeigte ein negatives Ergebnis: Obwohl die IS-Elemente IS407 und 'IS3Ea9' einen hohen Verwandtschaftsgrad zeigten, gehören die Wirtsbakterien den Gattungen Pseudomonas bzw. Enterobacter an. Andererseits kommen IS150, IS3 und IS3411 alle in E.coli vor, doch zeigte beispielsweise IS150 ein höheres Maß an Verwandtschaft mit IS861 (aus Streptococcus sp) als mit IS3 oder IS3411.

Entsprechend diesen Ergebnissen verläuft die Evolution von IS-Elementen offensichtlich unabhängig von der phylogenetischen Entwicklung jeweiliger Wirtsorganismen. Die Verbreitung bzw. Phylogenie von IS-Elementen über weite Zeiträume verläuft demnach nicht nur auf vertikaler, sondern auch in erhöhtem Maße auf horizontaler Ebene.

4.5.1 Lokalisierung von homologen Bereichen auf pEA9

Für viele IS-Elemente ist bekannt, daß sie in einer Wirtszelle nicht einzeln, sondern oft in einer variablen, für die jeweilige Wirtsspezies charakteristischen Kopienzahl vorkommen. Beispielsweise liegt IS3 bei E.coliK12 in fünf bis sechs Kopien vor, wobei davon zwei auf dem F-Plasmid, die restlichen drei bis vier chromosomal vorliegen [Iida et al., 1983]. Um festzustellen, ob sich auch in E.aggl.339 weitere Kopien von 'IS3Ea9' befinden, wurde zunächst untersucht, ob auf dem Plasmid pEA9 Homologiebereiche zu 'IS3Ea9' existieren, bei denen es sich um mögliche Kopien handeln könnte. Die Suche nach Homologiebereichen wurde mittels DNA-DNA-Hybridisierungen mit der 'IS3Ea9'-spezifischen 0.8 SB-Sonde durchgeführt (vgl. unter 4.1), wobei mögliche Homologiebereiche nach BamHI-Restriktionsverdau auf entsprechenden Fragmenten lokalisiert werden sollten. Da es sich bei pEA9 jedoch um ein Plasmid der Größe ~200 kb handelt, war für BamHI mit einer Vielzahl von Fragmenten zu rechnen (30 BamHI-Fragmente wurden bereits beschrieben [Steibl, 1989]) was eine spätere Zuordnung von Hybridisierungssignalen erschwert hätte.

Aus diesem Grunde wurden aus der Cosmid-Genbank von pEA9 [Steibl, 1989], in der ein Großteil des Plasmids kloniert vorliegt, pHD-Klone ausgewählt. So konnten spätere Hybridisierungssignale von pEA9 den jeweiligen pHD-Klonen zugeordnet werden, deren BamHI-Inserts größtenteil kartiert sind. Um zu entscheiden, welche pHD-Klone (es existieren 17 unterschiedliche Cosmidklone von pEA9) am geeignetesten erscheinen, wurde Plasmid-DNA von pHD39, pHD41, pHD62 und pHD54, die den gesamten klonierten Bereich abdeckten (vgl. Abb.28), sowie pJJ5.4HB als Positiv- und pUC18 als Negativkontrolle mittels Dot-Blot und anschließender Hybridisierung mit der 0.8 SB-Sonde 'vorgescreent' (Ergebnis nicht abgebildet). Der Hybridisierungsfilter zeigte eindeutige Signale bei pJJ5.4HB, pHD41 und pHD54, während pUC18, pHD39 und pHD62 kein Signal gaben. Offensichtlich existierten in der klonierten Region von pEA9 Homologiebereiche, die sich auf die in pHD41 und pHD54 klonierten Bereiche eingrenzen ließen.

Zur genauen Bestimmung der Anzahl und Lage von Homologiebereichen zu 'IS3Ea9' auf pEA9 wurde zuvor gewonnene Plasmid-DNA von pEA9 und den pHD-Klonen pHD21, pHD54, pHD41, pHD10 und pHD62, die den zuvor eingegrenzten Bereich der klonierten Region in verschiedenen Überlappungsmustern ihrer Inserts abdeckten (Abb.28), mit BamHI geschnitten und gelelektrophoretisch aufgetrennt. Nach Southern Blot des Agarose-Gels wurde der Filter mit der 0.8 SB-Sonde unter hoher Stringenz hybridisiert. Das Ergebnis ist in Abbildung 29 dargestellt.

Abbildung 28: Übersicht der klonierten Region von pEA9

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Abbildung 29: Restriktionsverdau von pEA9 und pHD-Cosmidklonen mit Hybridisierungsergebnis

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1 - Maßstab [cm] Spur 6: pHD41 + BamHI

Spur 2: l -DNA + HindIII Spur 7: pHD10 + BamHI

Spur 3: KBL Spur 8: pHD62 + BamHI

Spur 4: pHD21 + BamHI Spur 9: pEA9 + BamHI

Spur 5: pHD54 + BamHI Spur 10: KBL

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Das Hybridisierungsergebnis zeigte für pEA9 Signale bei vier BamHI-Fragmenten der Größen 1.3 kb, 2.7 kb, 5.9 kb und 9-9.8 kb, von denen zwei den entsprechenden Signalen im Bereich der pHD-Klone zugeordnet werden konnten: Das 5.9 kb BamHI-Fragment von pHD54 gab das erwartete Signal. Das zweite Signal ließ sich einer großen BamHI-Doppelbande > 9 kb zuordnen, die Signalen in pHD41 und pHD10 entsprach. Somit konnte es sich hier nur um die 9.4- und 9.6 kb BamHI-Fragmente handeln, die sich im Gel nicht auftrennen ließen. Da pHD10 ein Signal gab, stand fest, daß das 9.4 kb BamHI-Fragment mit Sicherheit hybridisiert (vgl. pEA9 Übersichtskarte in Abbildung 28). Jedoch war nicht ausschließen, daß auch das 9.6 kb BamHI-Fragment in der Doppelbande bei pEA9 und pHD41 hybridisiert: Ein Cosmid-Klon, der allein das 9.6 kb Fragment trägt, existiert nicht.

Die verbliebenen zwei Signale auf pEA9 bei 1.3 und 2.7 kb fanden im Bereich der pHD-Klone keine Entsprechung; diese Homologiebereiche liegen demnach außerhalb des klonierten Bereiches von pEA9 [Steibl, 1989].

Um den Homologiebereich auf dem 9.4 kb BamHI-Fragment genauer einzugrenzen, wurde eine Restriktionskartierung von pHD4 durchgeführt; es wurde dieser Cosmidklon ausgewählt, da er das besagte Fragment am Rand des 47.6 kb-Inserts trägt, an der Grenze zum pJA1-Vektor, und eine Kartierung könnte unter Umständen Hinweise auf die Orientierung des Inserts im Vektor liefern, was eine spätere Ansequenzierung vereinfachen würde. Zur Kartierung wurden die Restriktionsenzyme EcoRI, SphI, HindIII und BamHI im Einfach- und Doppelverau verwendet; BamHI deshalb, weil damit der Anschluß an die bereits bestehende BamHI-Restriktionskarte für das Insert gewährleistet war, und EcoRI hat im pJA1-Vektormolekül, ebenso wie SphI, nur eine singuläre Schnittstelle, was die Bestimmung der Orientierung des Inserts im pHD4 ermöglichen könnte.

Die Restriktionsverdaus wurden im Agarose-Gel elektrophoretisch aufgetrennt und nach Southern Blot und Hybridisierung des Kartierungsgels mit der 0.8 SB-Sonde zeigten die folgenden Restriktionsfragmente Hybridisierungssignale: 9.4 kb BamHI, 4.0 kb BamHI/SphI, 7.0 kb SphI, 5.2 kb SphI/EcoRI, 5.2 kb EcoRI, 3.9 kb EcoRI/BamHI, 2.6 kb EcoRI/HindIII, 2.6 kb HindIII, 2.6 kb SphI/HindIII und 2.3 kb BamHI/HindIII. Das Ergebnis der Restriktionsverdaus und Hybridisierung wurde in Abbildung 30 dargestellt.

Durch Auswertung dieses Restriktions- und Hybridisierungsmusters ließ sich eine Restriktionskarte im Bereich des 9.4 kb BamHI-Fragmentes von pHD4 erstellen. Der 'IS3Ea9'-homologe Bereich konnte dabei auf das 2.3 kb BamHI-HindIII-Fragment eingegrenzt werden - an der 'Grenze' des Inserts im pJA1-Vektor: Die Größe des 5.2 kb EcoRI- und 7.0 kb SphI-Fragmentes deuteten darauf hin, daß jeweils eine HindIII- und SphI-Schnittstelle bereits im Vektor kartierten. Denn hätte der IS-homologe Bereich auf der gegenüberliegenden Seite des 9.4 kb Fragmentes gelegen, müßte das im Insert angrenzende 11.5 kb BamHI-Fragment die Restriktionsschnittstellen für SphI und HindIII im gleichen Abstand zur BamHI-Schnittstelle aufweisen wie der pJA1-Vektor. Im Gelbild müßten diese gleich großen Restriktionsfragmente als Doppelbanden sichtbar sein. Da dies nicht der Fall war, stand die Orientierung des Inserts im pHD4 fest. Die resultierende Plasmidkarte von pHD4 wurde in Abbildung 31 dargestellt.

Abbildung 30: Restriktionsverdau von pHD4 mit Hybridisierungsergebnis

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Spur 1: KBL Spur 7: pHD4 + HindIII

Spur 2: pHD4 + BamHI + SphI Spur 8: pHD4 + HindIII + EcoRI

Spur 3: pHD4 + BamHI + HindIII Spur 9: pHD4 + EcoRI

Spur 4: pHD4 + SphI + EcoRI Spur 10: pHD4 + BamHI + EcoRI

Spur 5: pHD4 + SphI Spur 11: pHD4 + BamHI

Spur 6: pHD4 + SphI + HindIII

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Abbildung 31: Detailausschnitt der Plasmidkarte von pHD4

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Es ist nun möglich durch Sequenzierung des pHD4 unter Verwendung des pBR322-BamHI-'clockwise'-Primers zumindest Teile des IS-homologen Bereiches anzusequenzieren. Das Ziel wäre der konkrete Nachweis einer Kopie von 'IS3Ea9' oder einer entsprechenden Isoform durch Homologievergleiche.

4.5.2 Vorkommen von homologen Bereichen in der Gattung Enterobacter

Parallel zur Isolierung von E.aggl.339 wurden seinerzeit weitere Enterobacter-Stämme als Wildtyp-Isolate aus Rhizosphären von Weizenpflanzen aus der näheren Umgebung von Bayreuth charakterisiert [Kleeberger et al., 1983] und in weiteren Arbeitsgruppen des Lehrstuhls für Genetik untersucht. Beispielsweise gelang durch die Kurierung von E.aggl.335 und -339 (d.h., die Herstellung der kurierten Stämme E.aggl. 335/18-1 und -339/22-1) der Nachweis, daß die Fähigkeit zur Stickstoff-Fixierung plasmidkodiert auf pEA5 bzw. pEA9 vorliegt [Singh et al., 1983]. Von dem 'Laborstamm' E.aggl.339-, ursprünglich beschrieben als E.aggl.339/22-1 (s.o.), wurden die weiteren Stämme E.aggl.339-a, -b und -c hergestellt, die sich in ihren jeweiligen Antibiotikaresistenzen unterscheiden (vgl. Tab.1).

Da es sich nun bei pEA9 um ein selbsttransmissibles Plasmid handelt [Klingmüller et al., 1989] und auch IS-Elemente zumindest intraspezifisch eine hohe Mobilität via horizontalem Gentransfer aufweisen [Sawyer et al., 1987], war es naheliegend, bei E.aggl.339-verwandten Enterobacter-Stämmen weitere Kopien bzw. Isoformen von 'IS3Ea9' zu vermuten.

Um nun homologe Bereiche bei weiteren Enterobacter-Stämmen zu suchen, wurde Gesamt-DNA von E.aggl. 243, -333, -334, -335, -335/18-1, -339, -339/22-1 und Plasmid-DNA von pJJ5.4HB als Positivkontrolle in einem 'Vorscreening' nach einem Dot Blot mit der 0.8 SB-Sonde unter hoher Stringenz hybridisiert. Das Hybridisierungsergebnis ist in Abbildung 32 dargestellt.

Abbildung 32: Dot-Blot Hybridisierung von Enterobacter -Gesamt-DNA und pJJ5.4HB -Plasmid-DNA

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Das Hybridisierungsergebnis des Dot-Blots zeigte für E.aggl.333 und -334 kein Signal, während alle anderen Proben mehr oder weniger starke Hybridisierungssignale aufwiesen. Zur weiteren Beschreibung dieser im Dot-Blot gefundenen Homologiebereiche wurde Gesamt-DNA von E.coliDH5a, E.aggl.243, -335, -335/18-1, -339, -339/22-1, -339- a/b und c mit BamHI geschnitten und gelelektrophoretisch aufgetrennt. In diesem Zusammenhang wurde E.coliDH5a mitverwendet, um eine mögliche Verbreitung außerhalb der Enterobacteriaceae in der Gattung Escherichia zu testen. Nach Southern Blot des Agarose-Gels wurde die Nylonmembran mit der 0.8 SB-Sonde unter hoher Stringenz hybridisiert. Das Hybridisierungsergebnis ist in Abbildung 33 dargestellt.

Die Auswertung von diesem Hybridisierungsergebnis zeigte bei E.coliDH5a kein Signal. Damit deutet sich in einem Vorversuch die Möglichkeit an, daß der Verbreitungsbereich von 'IS3Ea9' die Gattung Escherichia nicht mit einschließt. Zum anderen besteht die Möglichkeit, daß die 'IS3Ea9'-spezifische 0.8 SB-Sonde nicht mit anderen IS3-Elementen kreuzhybridisiert.

Bei E.aggl.243 konnte ein einzelnes Hybridisierungssignal festgestellt werden, doch da dieses Signal einem BamHI-Fragment > 20 kb entsprach, ließ sich keine Aussage auf eine Bestimmung der Anzahl von Homologiebereichen treffen; schließlich könnte ein Fragment dieser Größe mehrere Homologiebereiche, d.h., Kopien von 'IS3Ea9', beinhalten.

Die Stämme E.aggl.335 und -339, bzw. -335/18-1 und -339/22-1 (mit -339--a, -b und -c), zeigten jeweils ein identisches Signalmuster. E.aggl.335/18-1 gab ein Signal, während E.aggl.335 vier zusätzliche Signale aufwies. Dasselbe Bild ergab sich für E.aggl.339 und -339/22-1, sowie die Formen a,b und c. Da es sich bei E.aggl.335/18-1 und -339/22-1 um jeweils kurierte, d.h. plasmidfreie Stämme handelte und ihnen die vier offensichtlich plasmidalen Signale fehlten, konnte das einzelne Signal nur ein chromosomaler Homologiebereich sein.

Die vier plasmidalen Signale von E.aggl.339 wurden bereits auf pEA9 lokalisiert; es handelt sich um das 1.3 kb, 2.7 kb, 5.9 kb und 9.4 kb BamHI-Fragment von pEA9. Das fünfte (chromosomale) Signal ließ sich einem BamHI-Fragment von ca. 2 kb zuordnen.

Im Laufe der letzten Jahre kam es durch neue Ergebnisse zur Taxonomie und Klassifizierung innerhalb der Enterobacteriaceae zu einer Reihe von Umstellungen in der Nomenklatur. Mittels phänotypischer Untersuchungen und DNA-DNA-Hybridisierungen wurde die 'Enterobacter agglomerans - Erwinia Gruppe' durch Schaffung der neuen Gattung Pantoea, der die Spezies Pantoea agglomerans und Pantoea dispersa angehören, aufgelöst. Der Enterobacter agglomerans Typ-Stamm ATCC 27155 und Erwinia herbicola Typ-Stamm NCPPB 2971 wurden nun Pantoea agglomerans zugeordnet; Erwinia herbicola ATCC 14589 wurde als neuer Pantoea dispersa-Typ-Stamm klassifiziert [Gavini et al., 1983 u. 1989; Beji et al., 1988].

Abbildung 33: Restriktionsverdau von Enterobacter- und Escherichia- Gesamt-DNA mit Hybridisierungsergebnis

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Spur 1: cm-Maßstab Spur 8: E.aggl.339 + BamHI

Spur 2: l -DNA + HindIII Spur 9: E.aggl.335/18-1 + BamHI

Spur 3: KBL Spur 10: E.aggl.335 + BamHI

Spur 4: E.aggl.339-c + BamHI Spur 11: E.aggl.243 + BamHI

Spur 5: E.aggl.339-b + BamHI Spur 12: E.coliDH5a + BamHI

Spur 6: E.aggl.339-a + BamHI Spur 13: KBL

Spur 7: E.aggl.339/22-1 + BamHI

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Durch Verwendung physiologischer Standard-Testsysteme, basierend auf dem Prinzip des 'Enterotubes', und Bestimmung sogenannter API-Codes (Appareils et Procédés d'Identification, bioMérieux), wurden weitere Umgruppierungen von Enterobacter-Stämmen vorgeschlagen: E.aggl.339 und -335 [Kleeberger et al., 1983] sollten Rahnella aquatilis, zugeordnet werden; bei E.aggl.333 und -334 könnte es sich um Enterobacter amnigenus, E. intermedium oder ebenfalls um Rahnella aquatilis handeln [Berge et al., 1991; Korrespondenz Berge O. und Klingmüller W., 1991].

Aufgrund dieser neuer Ergebnisse zur Taxonomie der von Kleeberger beschriebenen Enterobacter agglomerans-Stämme [Kleeberger et al., 1983] war es interessant zu erfahren, ob die für eine neue Nomenklatur vorgeschlagenen Referenzstämme homologe Bereiche zu 'IS3Ea9' aufweisen.

Um mögliche Homologiebereiche zu 'IS3Ea9' in den vorgeschlagenen Referenzstämmen nachzuweisen, wurde Gesamt-DNA von E.aggl.19-78, Pantoea agglomerans und der Rahnella aquatilis-Stämme R.a.ATCC 33989, R.a.2-87, R.a.3-88 und R.a.ATCC 33071 in einem 'Vorscreening' mit E.aggl.339 als Positiv- und E.aggl.333 als Negativkontrolle nach Dot-Blot im Hybrislot-Verfahren mit der 0.8 SB-Sonde unter hoher Stringenz hybridisiert. Das Hybridisierungsergebnis ist in Abb.34 dargestellt.

Mit Ausnahme von Rahnella aquatilis ATCC 33989 und der Negativkontrolle E.aggl.333 zeigten alle Stämme ein mehr oder weniger starkes Hybridisierungssignal, was vermuten läßt, daß letztere zumindest einen Homologiebereich, d.h., eine Kopie von 'IS3Ea9', enthalten. Damit bestätigte sich auch in diesem Vorversuch die von Berge beschriebene, große Übereinstimmung zwischen den von Kleeberger charakterisierten Enterobacter- und Rahnella-Stämmen, bzw. Pantoea agglomerans [Berge et al., 1991; Kleeberger et al., 1983].

Während alle vorhergehenden Untersuchungen physiologische Übereinstimmungen aufzeigten [Berge et al., 1991], konnten hier jedoch erstmals Homologiebereiche auf DNA-Ebene gezeigt werden.

Abbildung 34: Dot-Blot Hybridisierung von Enterobacter-, Pantoea- und Rahnella-Gesamt-DNA

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1: E.aggl.339 5: Rahnella aquatilis 3-88

2: E.aggl.19-78 6: Rahnella aquatilis ATCC 33071

3: Rahnella aquatilis ATCC 33989 7: Pantoea agglomerans

4: Rahnella aquatilis 2-87 8: E.aggl.333

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