5 Diskussion

 

Bei bakteriellen Insertionssequenzen (IS) handelt es sich um kleine, genetisch kompakte DNA-Strukturen, die eine Vielzahl verschiedener genetischer Veränderungen in der jeweiligen Wirtszelle hervorrufen können. Sie sind weit verbreitet und nach heutigem Wissensstand können sie außerhalb der Zelle nicht existieren. Bisher wurden über 100 verschiedene IS-Elemente beschrieben und in bestimmten Bakterienstämmen können sie einen erheblichen Teil des Wirtsgenoms ausmachen [Nyman et al., 1981].

In dieser Arbeit wurde ein neues IS-Element bei Enterobacter agglomerans 339 kloniert, vollständig sequenziert und charakterisiert. Desweiteren wurden Untersuchungen zum Vorkommen und Verbreitung des IS-Elementes innerhalb der Enterobacteriaceae durchgeführt.

Im Rahmen der Sequenzierung wurde die komplette Sequenz des IS-Elementes 'IS3Ea9' ermittelt. Durch die zusätzliche Sequenzierung flankierender Bereiche konnte dabei der bisher sequenzierte Bereich von pEA9 um insgesamt 2.4 kb erweitert werden.

In der DNA-Sequenz von 'IS3Ea9' wurden zwei offene Leseraster mit potentiellen Shine-Dalgarno-Sequenzen gefunden, bezeichnet als orfA und orfB, die in Phase 0 (orfA) bzw. -1 (orfB) kodieren. Desweiteren konnten vor orfA und auch auf dem Gegenstrang von orfB Promotorstrukturen nachgewiesen werden.

Nach Ableitung der jeweiligen AS-Sequenz von orfA bzw. orfB und anschließenden Datenbankrecherchen ergab sich sowohl für ORFA, als auch für ORFB, eine Homologie von insgesamt 30-65 % identischer AS zu offenen Leserastern von IS-Elementen der IS3-Familie. Die Untersuchung der Zusammensetzung von ORFA und ORFB ergab einen stark basischen Charakter, wie er auch für vergleichbare Proteine anderer IS-Elemente bekannt ist. Von dieser Eigenschaft wird in entsprechender Referenzliteratur die DNA-bindende Wirkung dieser Proteine abgeleitet, die für einige IS-Elemente bewiesen wurde [Prentki et al., 1987; Polard et al., 1991]. Zusätzlich wurde in ORFA von 'IS3Ea9' ein potentielles Helix-Turn-Helix-Motiv gefunden. Von großer Bedeutung war dieses Ergebnis deshalb, weil das derzeitige Modell zur Funktion von ORFA auf dieser Eigenschaft aufbaut [Prère et al., 1990; Polard et al., 1991]: Direkt anschließend an seine Transkription und Translation bindet ORFA wieder an den DNA-Strang mit dem IS-Element. Dabei verhindert die positive Nettoladung von ORFA ein Abdiffundieren von der negativ geladenen DNA. Nach Migration entlang des Stranges erfolgt eine feste Bindung des ORFA-Helix-Turn-Helix-Motivs an spezifische Bindungsstellen im Bereich der 'Inverted Repeats'. Von essentieller Bedeutung erwies sich im IR von IS911 der 36 bp-, bei IS1 der 23 bp-Terminus, wie durch DNaseI-Abbau an teildeletierten IS-Elementen gezeigt werden konnte [Polard et al., 1991]. Der Mechanismus ließ sich bisher erst bei IS1 durch Komplementationsversuche vollständig belegen. Die Komplementation von ORFA in cis erschien dabei um einen Faktor 100 effizienter als in trans [Machida et al., 1982; Prentki et al., 1987a].

Aufgrund von Literaturangaben, die für IS3-Elemente und auch IS1 ein ribosomales 'Frameshifting' beschreiben, das nach einem Rasterschub während der Translation am Ende von ORFA von Phase 0 nach -1 die Bildung eines ORFAB-Fusionsproteins bewirkt [Chandler u. Fayet, 1993], wurde die Sequenz von 'IS3Ea9' nach einem derartigen 'Frameshift-Fenster' untersucht. Als mögliche Sequenzmotive wurden bisher zwei Typen von 'Frameshift-Fenstern' nachgewiesen: Typ I beinhaltet ein Heptanukleotid-Motiv der allgemeinen Form YYYXXXZ, das anscheinend am weitesten verbreitet ist, während Typ II ein Motiv der Form XXXZ vorsieht, dessen 'Frameshift'-Effizienz durch die Nähe von Stoppcodons, Sekundärstrukturen der mRNA, Codongebrauch der Wirtszelle und ribosomale Bindestellen bestimmt wird [Chandler u. Fayet, 1993].

In der Sequenz von 'IS3Ea9' konnte im 3'-Ende von orfA ein 'Frameshift'-Motiv vom Typ II gezeigt werden, das auch die oben genannten Voraussetzungen erfüllt: Die Motiv-Sequenz AAAG, der im kurzen Abstand das TGA-Stoppcodon von orfA folgt, wird von 'Inverted Repeats' eingerahmt, die mRNA-Sekundärstrukturen in Form von Haarnadelschleifen bilden könnten. Aus dem Codongebrauch für Lysin (AAG) im chromosomalen recA-Gen bei E.aggl.339 [Rappold, 1993] konnte desweiteren auf eine verringerte Zahl oder ein Fehlen der entsprechenden Aminoacyl-tRNA für ein AAG-Anticodon geschlossen werden. Bei der 20 bp in 3'-Richtung liegenden Shine-Dalgarno-Sequenz von orfB könnte es sich um die ein 'Frameshifting' begünstigende Ribosomen-Bindestelle handeln. Durch ein Alignment von potentiellen ORFAB-Fusionsproteinen konnte eine Konservierung im Übergangsbereich von orfA-orfB auch bei 'IS3Ea9' gezeigt werden, was für die Translation dieser Bereiche spricht und die Bildung eines ORFAB-Fusionsproteins untermauert.

Bei den IS-Elementen IS911 und IS150 der IS3-Familie konnten die Fusionsproteine experimentell nachgewiesenen werden [Polard et al., 1991; Vögele et al., 1991]. Daß es sich bei diesem Fusionsprotein um die aktive Transposase handelt, wurde bei IS911 durch Versuche mit mutierten 'Frameshift'-Motiven und anschließender Überexpression in T7-Systemen nachgewiesen [Polard et al., 1991]: Die Bildung von ORFAB hatte einen direkten Einfluß auf die Transpositionsrate in vivo. Eine Überproduktion von ORFAB bewirkt sowohl in cis, als auch in trans eine verstärkte Transposition: Das Protein stimuliert intermolekulare Transposition und die Bildung von kovalent geschlossenen, supercoiled, zirkulären Kopien des IS-Elementes [Polard et al., 1991]. Das Zusammenwirken von ORFA und ORFB mit ORFAB-Fusionsproteinen wurde ebenfalls bei IS911 detailliert untersucht. Während die Funktion und Bedeutung von ORFB weitgehend unbekannt blieb, wurde für ORFA in diesem Zusammenhang eine Modulatorwirkung beschrieben: ORFAB-Aktivität wird auf Kosten der intramolekularen Ringbildung in Richtung intermolekularer Transposition gelenkt [Chandler u. Fayet, 1993]. Aufgrund der ausgeführten Homologien zwischen 'IS3Ea9' und IS3-Elementen ist für 'IS3Ea9' ein entsprechender Mechanismus sehr wahrscheinlich.

Eine Abweichung zu der charakteristischen Struktur von IS-Elementen ergab die Untersuchung der Randbereiche von 'IS3Ea9': Der Bereich der offenen Leseraster wird von 44 bp langen 'Inverted Repeats', die ein hohes Maß an Übereinstimmung mit 'Inverted Repeats' von IS3-Elementen zeigten, eingerahmt, doch außerhalb dieser 'Inverted Repeats' konnten keine direkten Sequenzwiederholungen ('Direct Repeats') gefunden werden. In der Literatur zwei Fälle bei IS-Elementen und Transposons beschrieben, die bei Transposition keine 'Direct Repeats' produzieren. Es handelte sich dabei (1) um ein phagenähnliches Transposon, für das ein ganz anderer Transpositionsmechanismus postuliert wurde [Murphy u. Löfdahl, 1984] und (2) IS91, das keine 'Direct Repeats' bei der Transposition produziert [Diaz et al., 1987], steht ebenfalls in keinem Verwandtschaftsverhältnis zu der in diesem Zusammenhang beschriebenen IS3-Familie.

Es ist nicht anzunehmen, daß 'IS3Ea9' bei der bereits nachgewiesenen Sequenz- und Strukturhomologie zur IS3-Familie, im Bezug auf den Transpositionsmechanismus eine Ausnahme zu allen bereits beschriebenen IS-Elementen darstellt. Dagegen ist es viel wahrscheinlicher, daß 'IS3Ea9', aufgrund der Homologie zur IS3-Familie, vergleichbar dem IS911, nach einem konservativen Transpositionsmechanismus in die Zielsequenzen integrierte [Prère et al., 1990; Polard et al., 1991] und dabei 'Direct Repeats' in einer Länge von 3 oder 4 bp erzeugte. Im ß-Terminus des IS-Elementes wurde die Sequenz im Doppelstrang bestimmt, so daß die Sequenzdaten in diesem Bereich abgesichert waren. Eine nachweisbare Erklärung für das Fehlen von 'Direct Repeats' konnte nicht gefunden werden.

Als Ergebnis von Datenbankrecherchen wurde in einem sequenzierten Bereich des Virulenzplasmids pIB1 von Yersinia pseudotuberculosis ein Bereich hoher Sequenz-homologie zum orfB von 'IS3Ea9' gefunden. Weitergehende Sequenzauswertungen haben ergeben, daß es sich bei der homologen Struktur um den ansequenzierten ß-Terminus eines noch nicht beschriebenen IS3-Elementes handeln könnte.

 

Durch Hybridisierungen mit einer 'IS3Ea9'-spezifischen DNA-Sonde konnten in E.aggl.339 mindestens fünf homologe Bereiche zu 'IS3Ea9' nachgewiesen werden. Da die Hybridisierung unter hoher Stringenz durchgeführt wurde, konnte es sich dabei nur um zu 'IS3Ea9' identische DNA-Sequenzen handeln, d.h., Kopien oder zumindest Isoformen des IS-Elementes.

Von den fünf abgesicherten Kopien konnte eine chromosomal, die anderen vier plasmidal lokalisiert werden, da die mit BamHI geschnittene Gesamt-DNA vom E.aggl.339 Wildtyp alle fünf Signale, der kurierte E.aggl.339/22-1 im BamHI-Verdau jedoch nur ein Signal zeigte. Die Möglichkeit, daß ein Restriktionsfragment mit Hybridisierungssignal mehr als eine Kopie enthalten könnte, ließ sich bereits aufgrund der jeweiligen Fragmentgrößen ausschließen, da diese nicht mehr als eine Kopie von 'IS3Ea9' zuließen. Die einzige Ausnahme in diesem Zusammenhang bildet das 9.6 kb BamHI-Fragment, dem sich kein eindeutiges Hybridisierunggssignal zuordnen ließ. Entsprechend den Konventionen zur Nomenklatur von IS-Elementen [Deonier, 1987] werden für die fünf postulierten IS-Elemente die vorläufigen Bezeichnungen 'IS3Ea9'A bis -E vorgeschlagen (Tab.16). Von den vier plasmidalen Kopien auf pEA9 wurden zwei im nicht-klonierten und -kartierten Bereich lokalisiert, die übrigen zwei in der klonierten Region der pHD-Cosmid-Klone.

Tabelle 16: Bezeichnung der zu 'IS3Ea9' homologen Bereiche in E.aggl.339

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Bezeichnung des IS-Elemnetes Replikon Anmerkung

'IS3Ea9'A pEA9 kloniert auf 5.9 kb-BamHI-Fragm. / pHD54

'IS3Ea9'B pEA9 kloniert auf 9.4 kb-BamHI-Fragm. / pHD4

'IS3Ea9'C pEA9 nicht kloniert, 2.7 kb-BamHI-Fragment

'IS3Ea9'D pEA9 nicht kloniert, 1.3 kb-BamHI-Fragment

'IS3Ea9'E Chromosom nicht kloniert, ~2 kb-BamHI-Fragment

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Durch die Restriktionskartierung der Cosmidklone pHD4 und pHD54 wurde die genaue Lage von 'IS3Ea9'A und 'IS3Ea9'B auf den jeweiligen BamHI-Fragmenten bestimmt und ermöglichte die Zuordnung auf der BamHI-Restriktionskarte von pEA9 (Abb.35).

Eine entsprechende Zuordnung von 'IS3Ea9'C und -D war nicht möglich, da über die Lage der 1.3 kb und 2.7 kb-BamHI-Fragmente keine Erkenntnisse vorlagen. Infolgedessen besteht zwar die Möglichkeit, daß die genannten IS-Elemente als terminale Strukturen von Transposons vorliegen, doch ist im konkreten Fall keine definitive Zuordnung von IS-Element und Transposon-Überstruktur bzw. Größe und Orientierung des Transposons möglich. Daß es sich bei der von 'IS3Ea9'A und -B flankierten Region um ein Transposon handelt, ist aufgrund der resultierenden Größe der Struktur von ca. 89 kb unwahrscheinlich, da sich Transposongrößen generell in einem Bereich von 5 kb (Tn3) bis 20 kb (Tn4) bewegen.

 

Abbildung 35: BamHI-Restriktionskarte der klonierten Region von pEA9

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Abbildung 35: Dargestellt ist die BamHI-Restriktionskarte der klonierten Region von pEA9. BamHI wurde als B angekürzt. Kopien von 'IS3Ea9' wurden als offene Boxen mit einem Pfeil gekennzeichnet. Die graue Box symbolisiert das nif-Cluster.

Mit den dargelegten Ergebnisse ist es gelungen, weiteren Bereichen von pEA9 eine funktionelle Bedeutung zuzuordnen: Durch Sequenzierung, anschließende Hybridisierung und Lokalisierung von Kopien des IS-Elementes konnte der untersuchte Bereich von pEA9 um insgesamt 6 kb erweitert werden.

Hybridisierungen von E.aggl.335 mit der 0.8 SB-'IS3Ea9'-Sonde ergaben jeweils identische Signalmuster wie bei E.aggl.339: E.aggl.335 zeigte die gleiche Anzahl von potentiellen Kopien des IS-Elementes auf BamHI-Fragmenten gleicher Größe. Dieses Ergebnis stimmt überein mit Ergebnissen anderer Arbeitsgruppen, die in der Vergangenheit versuchten, E.aggl.335 und -339 mittels verschiedenster Methoden zu unterscheiden: Der Versuch, beide Enterobacter-Stämme auf physiologischer Ebene durch die Bestimmung der API-Codes zu unterscheiden, blieb erfolglos, da sich für E.aggl.335 und -339 der identische Wert von API20EC- 0 657 501 ergab. Allerdings zeigte dieses Ergebnis eine hohe Ähnlichkeit beider Stämme zum Rahnella aquatilis Typ-Stamm ATCC 33071, was die Neuklassifizierung von E.aggl.335 und -339 als Rahnella aquatilis notwendig machen könnte. [Berge et al., 1991; Korrespondenz Berge O., Klingmüller W., 1991]. Eine Unterscheidung der beiden Enterobacter-Stämme war auch durch Pulsed Field Gelelektrophorese nicht möglich [Evguenieva et al., 1993, im Druck] und erst mit Metho-den der AP-PCR konnten bei der Verwendung unterschiedlicher Primer und Variation der PCR-Parameter Unterschiede im Restriktionsmuster von E.aggl.335 und -339 gezeigt werden [Selenska-Pobell et al., 1993, im Druck]. Zusammen mit den physiologischen Kennzeichen aus der Erstbeschreibung sind dies die einzigen zur Zeit verfügbaren Unterscheidungskriterien. Im Rahmen der Erstbeschreibung der beiden Stämme ergaben physiologische Eigenschaften den Ausschlag für die Klassifizierung:

Während E.aggl.335 im Gegensatz zu E.aggl.339 Gelatine hydrolysiert, bildet E.aggl.339 bei Wachstum auf Glycerin Säure, wozu E.aggl.335 nicht in der Lage ist [Kleeberger et al., 1983; Singh et al., 1983].

Die Hybridisierung von E.aggl.243 mit der 0.8 SB-'IS3Ea9'-Sonde gab ein Hybridisierungssignal auf einem BamHI-Fragment > 20 kb. Damit wurde mindestens eine Kopie des IS-Elementes in diesem Stamm nachgewiesen. Sollten spätere Untersuchungen zeigen, daß sich dieser Homologiebereich dem 200 kb Plasmid pEA2 zuordnen läßt, wäre es interessant ob sich aus der Anzahl, Verteilung und DNA-Sequenz von 'IS3Ea9'-Kopien Homologien zwischen den 200 kb Plasmiden pEA2, pEA5 und pEA9 ableiten ließen.

Die Hybridisierung von E.aggl.333 und -334 mit der 0.8 SB-'IS3Ea9'-Sonde zeigte in beiden Fällen keine Hybridisierungssignale; dementsprechend befindet sich keine Kopie in diesen Bakterienstämmen. Dies war um so mehr erstaunlich, da diese Stämme zusammen mit E.aggl.243, -335 und -339 aus identischen Rhizosphärenbereichen isoliert worden waren [Kleeberger et al., 1983]. Wenn demnach keine räumliche Barriere die Einwanderung von 'IS3Ea9' in E.aggl.333 und -334 stoppte, waren es möglicherweise Gattungs- oder Speziesgrenzen, die das IS-Element nicht überwinden konnte. Gestützt wurde dieses Ergebnis durch physiologische Tests und Bestimmung von API-Codes, welche die Stämme E.aggl.333 und -334 weiter von der übrigen E.aggl.-Gruppe abgrenzten: E.aggl.333 und -334, die beide den gleichen API20EC Code 4 657 501 hatten, wurden als mögliche Enterobacter amnigenus, Enterobacter intermedium oder Rahnella aquatilis eingestuft [Berge et al., 1991; Korrespondenz Berge O., Klingmüller W., 1991].

Studien zur Evolution von IS-Elementen zeigten, daß sich IS-Elemente durch eine hohe Wirtsspezifität auszeichnen. Zwar verfügen sie gleichzeitig über eine hohe intraspezifische Mobilität [Sawyer et al., 1987], doch ist der horizontale Transfer auf interspezifischer Ebene relativ selten [Lawrence et al., 1991]. Beispielsweise konnte in Salmonella typhimurium kein IS-Element von E.coliK12 nachgewiesen werden [Galas u. Chandler, 1989] und umgekehrt [Lam u. Roth, zitiert in Lawrence et al., 1991], obwohl beide Gattungen einen hohen Verwandtschaftsgrad, bezogen auf genomische DNA-Sequenzhomologien, besitzen. Ein enger Wirtsbereich ist demnach ein charakeristisches Merkmal von IS-Elementen, ebenso wie die Konserviertheit der DNA-Sequenz innerhalb einer Wirtsspezies. Ausgehend von diesen Überlegungen werden Bakterienstämme zunehmend anhand ihrer IS-Elemente klassifiziert, denn sowohl die Sequenzhomologie eines IS-Elementes mit einer jeweiligen Isoform [Lawrence et al., 1992] als auch die Kopienzahl sind in hohem Maße wirtsspezifisch [Iida et al., 1983].

 

Im Rahmen einer systematischen Methodik entspricht die Charakterisierung von IS-Elementen und deren Kopienzahl innerhalb einer Bakterienspezies einem 'Fingerabdruck' des jeweiligen Wirtsorganismus und erlaubt eine phylogenetische Klassifizierung der jeweiligen Spezies. Entsprechende Untersuchungen wurden im Bereich der Enterobacteriaceae bereits bei Shigella sp., Salmonella sp. und Enterobacter sp. durchgeführt [Matsutani u. Ohtsubo, 1993].

Um die bereits aufgegriffene Problematik der Neuklassifizierung von Enterobacter agglomerans 243, -333, -334, -335 und -339 methodisch neu aufzugreifen, würde es sich anbieten, diese Stämme und auch die postulierten Referenzstämme, wie Rahnella aquatilis, mittels 'Fingerprinting'-Methode zu charakterisieren und in ein dementsprechendes Taxon einzuordnen.

In einem Vorversuch wurde Gesamt-DNA von Rahnella-, Pantoea- und Enterobacter-Stämmen mit der 0.8 SB-'IS3Ea9'-Sonde in einem Dot Blot unter hoher Stringenz hybridisiert. Das Ergebnis zeigte, daß bis auf Rahnella aquatilis ATCC 33989 und E.aggl. 333 als Negativkontrolle alle eingesetzten Stämme mindestens eine Kopie von 'IS3Ea9' tragen. Je nach Stärke des Hybridisierungssignals ließe sich sogar auf eine mehrfache Kopienzahl spekulieren, da für den Dot Blot äquimolare DNA-Mengen eingesetzt wurden.

Da die meisten Stämme bereits einen Homologiebereich zu 'IS3Ea9' aufwiesen, wäre es für eine weitere Klassifizierung in diesem Bereich der Enterobacteriaceae interessant, für jeden der aufgeführten Stämme den jeweiligen 'Fingerabdruck' der Hybridisierungssignale zu ermitteln. Unter Umständen ließen sich damit weitergehende phylogenetische Aussagen treffen.

Die für das IS-Element spezifische Sonde erwies sich in den durchgeführten DNA-DNA-Hybridisierungen als ein nützliches Werkzeug zur Untersuchung verschiedener Stämme. Es bietet sich an, diese Sonde auch für weitergehende Arbeiten zur Klassifikation von Stämmen im Bereich der Enterobacteriaceae zu verwenden.

Für weitere, biochemisch/molekulargenetische Untersuchungen an dem IS-Element selbst, wie zum Beispiel der Bestimmung der Transpositionsrate, Promoterstärken oder dem Nachweis von ribosomalem 'Frameshifting', steht nunmehr ein Klon (pJJ3.8SphA) zur Verfügung, der das vollständige IS-Element enthält.



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